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《兰州大学》 2017年
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砂生槐种子生物碱抗包虫效应及机制研究

雒艳萍  
【摘要】:研究背景包虫病是主要由棘球蚴或泡球蚴寄生于人体或动物体内引起的人兽共患寄生虫病,在全球广泛流行,严重危害人类健康和生命安全。目前,治疗包虫病以手术为主,但无法耐受手术或病情复杂而无法进行手术的患者,只能依赖药物治疗,而获批临床使用的药物仅有阿苯达唑和甲苯达唑两种,品种单一,疗效不理想,并且发现副作用多而严重,耐药现象日益增多。因此,亟需研发疗效明确、副作用小的抗包虫药物。从祖国传统医学的数千年治疗虫病的经验中寻找线索,是发掘抗包虫药物的一个重要途径。砂生槐为青藏高原特有植物,藏医记载其种子性苦、寒,具有治疗白喉、虫病、中毒症、消化不良等功效。本实验室在前期研究中发现砂生槐种子亲脂性总生物碱在体外具有杀灭细粒棘球蚴原头节活性,在体内可抑制小鼠继发性棘球蚴生长,提示砂生槐种子总碱中含有驱虫成分。但砂生槐种子在藏医中以水煎剂入药,亲脂性总碱水溶性差、抗虫效果弱,因此,本课题从砂生槐种子的水溶性成分中寻找有效的抗包虫成分并研究其抗虫机制。研究方法以乙醇为溶剂,采用热回流提取法分离砂生槐种子生物碱,以秀丽隐杆线虫为模型,对砂生槐种子的分离产物进行杀虫活性筛选。采用柱层析分离法,从杀虫活性较强的成分中提取极性较小的馏分和极性较大的馏分,TLC定性鉴定馏分的成分,通过秀丽隐杆线虫确定砂生槐种子的杀虫活性成分,并通过HPLC分析其主要化学成分。分离自然感染羊肝细粒棘球蚴原头节,在体外与砂生槐种子成分共同培养7天,观察原头节形态变化及存活情况,进一步确定砂生槐种子的杀虫活性成分。NIH小鼠腹腔注射细粒棘球蚴原头节建立慢性棘球蚴病模型,BALB/c小鼠腹腔注射泡球蚴建立慢性泡球蚴病模型,分别于感染后20 w和14 w用砂生槐种子杀虫活性成分灌胃治疗,剂量为100 mg/kg/day,治疗6 w后剖杀小鼠检测。剥离棘球蚴囊泡组织,称量湿重,常规HE染色;FCM分析脾脏CD3+、CD4+、CD8+和PD-1+的T细胞亚群;ELISA检测IFN-γ和IL-4水平;CFSE染色检测脾细胞增殖能力。以秀丽隐杆线虫为模式生物,检测砂生槐种子杀虫活性成分作用后秀丽隐杆线虫的运动行为能力、生殖能力、寿命、体长及ROS水平,反映其抗虫机制。体外培养肝细胞株Hep G-2细胞和Chang liver细胞,MTT法检测砂生槐种子杀虫活性成分对细胞生长的影响;BALB/c小鼠口服砂生槐种子杀虫活性成分(100 mg/kg/day)6 w后,检测血清肝肾生化指标和病理变化,评价砂生槐种子杀虫活性成分的毒副作用。Ⅲ型干扰素成员IL-28B与抗原EAMMH在0、3、6 w同时注射C57BL/6小鼠,10 w分离脾细胞,FCM分析CD4+CD25+Foxp3+Treg占脾淋巴细胞比例,ELISPOT检测分泌IFN-γ的T细胞数目,间接ELISA检测抗原特异性Ig G1和Ig G2c水平,反映IL-28B对Treg及免疫应答的调节作用,为其应用于包虫病治疗奠定基础。研究结果本课题从砂生槐种子获得4种提取物:非水溶性生物碱(E1)、水溶性生物碱(E2)、水溶性非生物碱(E3)和不溶性非生物碱(E4)。E1、E2、E3和E4的杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别为31.03 mg/ml、14.29 mg/ml、29.94 mg/ml和25.64 mg/ml,E2的LC50最低。从E2中提取到极性较小的馏分E2-a和极性较大的馏分E2-b。E2-a和E2-b杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别是9.06 mg/ml和36.24 mg/ml。TLC定性鉴定,E2-a含有苦参碱和槐果碱,E2-b含有氧化苦参碱和氧化槐果碱。苦参碱和槐果碱杀秀丽隐杆线虫的24 h-LC50分别是12.03 mg/ml和9.81 mg/ml。HPLC分析100μg/ml E2-a中苦参碱和槐果碱的含量分别为42.8μg/ml和25.7μg/ml。E2-a体外作用于细粒棘球蚴原头节后,虫体出现皱缩、一端或两端出现气泡、吸盘变形、顶突明显外翻等异常表现,活性降低。E2-b、E2、苦参碱、槐果碱在体外对原头节活性均有不同程度影响。杀原头节的72 h-LC50值由低到高依次是E2-a(0.35 mg/ml)、E2(0.45 mg/ml)、槐果碱(0.79 mg/ml)、苦参碱(1.16 mg/ml)、E2-b(2.12 mg/ml),E2-a的LC50值最低。治疗小鼠慢性棘球蚴病的结果表明,E2-a组的棘球蚴囊泡组织湿重(8.40±2.93 g)明显低于阴性对照组(11.33±1.64 g)(p=0.042);E2-a组的囊泡生发层与角皮层部分剥离,角皮层增厚,变得疏松,出现大量泡状物,失去典型的纹状结构,与外膜之间的界限变得模糊不清;E2-a组小鼠脾脏CD3+T细胞占脾淋巴细胞的比例(45.14%±23.93%)高于阴性对照组(14.74%±9.39%)(p=0.011),且主要是CD4+T细胞比例(72.28%±3.63%)高于阴性对照组(50.33%±27.92%)(p=0.036)所致,CD8+T比例无明显升高或降低(p0.05);E2-a组小鼠PD-1+T细胞比例(9.92%±6.77%)显著低于阴性对照组(25.51%±13.53%)(p=0.009),且CD4+PD-1+T细胞比例为5.73%±1.62%,明显低于阴性对照组(12.59%±6.35%)(p=0.023),CD8+PD-1+T细胞比例为0.86%±0.35%,明显低于阴性对照组(2.77%±1.87%)(p=0.020);E2-a组小鼠血清IFN-γ水平无明显变化,血清IL-4浓度平均为4.21 pg/ml,与阴性对照组(1.13 pg/ml)比较有升高趋势;E2-a组抗原刺激后脾细胞培养上清中IL-4浓度平均为5.75 pg/ml,与阴性对照组(3.10 pg/ml)比较有升高趋势;E2-a组小鼠脾细胞增殖能力无增高。治疗慢性泡球蚴病小鼠的结果表明,E2-a组小鼠的泡球蚴囊泡组织湿重为6.10±2.16 g,显著低于阴性对照组(11.25±1.73 g)(p0.01),平均降低囊重约5.15 g;E2-a组小鼠血清INF-γ水平无降低,IL-4浓度平均为48.46pg/ml,较阴性对照组(32.08 pg/ml)明显升高(p=0.032)。秀丽隐杆线虫的运动行为能力检测结果表明,8 mg/ml的E2-a作用24 h后,引起秀丽隐杆线虫的身体弯曲频率降为阴性对照组的1/3(p0.01);头部摆动频率平均为34.5次/min,明显低于阴性对照组(59.1次/min)(p0.01);咽泵频率平均为38.9次/min,低于阴性对照组(71.4次/min)(p0.01)。E2-a能够抑制秀丽隐杆线虫的排卵功能,8 mg/ml的E2-a处理后的秀丽隐杆线虫每条虫排卵总数平均为205.2,明显低于阴性对照(248.8/虫)(p0.01),在第3天和第4天的排卵量分别平均为36.8/虫和13.2/虫,明显低于阴性对照组(分别为54.4/虫和28.2/虫)(p0.05),但AO染色未发现生殖细胞凋亡增多。8 mg/ml E2-a组线虫的寿命为9.1±4.1天,明显低于阴性对照组(13.0±4.6天)(p=0.021)。8mg/ml E2-a组线虫的体长平均为447.6 pixels,明显短于阴性对照组(486.8 pixels)(p0.01)。E2-a无诱导ROS水平升高的作用。体外MTT实验证明,浓度为1 mg/ml的E2-a作用48 h后,Hep G-2细胞和Chang liver细胞的抑制率分别为29.03%和38.36%,因此低浓度E2-a对肝细胞株Hep G-2和Chang liver细胞的增殖有一定抑制作用。小鼠口服E2-a后检测血清肝肾生化指标,发现反映肝功能的指标谷丙转氨酶(38.333 U/L±4.726 U/L)和谷草转氨酶(150.000 U/L±35.763 U/L)较阴性对照组(谷丙转氨酶和谷草转氨酶分别为33.333 U/L±7.638U/L和139.667 U/L±30.172 U/L)略升高,反映肾功能的的指标肌酐(18.000μM/L±1.000μM/L)较阴性对照组(11.000±7.211μM/L)略升高,但均无统计学差异,其余指标无明显升高或降低,组织学检查未发现肝肾细胞出现明显改变。包虫感染中Treg增多,造成感染持续,故下调Treg是治疗包虫病的策略之一,本课题研究了Ⅲ型干扰素成员IL-28B对Treg的调节作用。结果表明,EAMMH-r Ad-m IL-28B组的Treg比例为0.17%±0.17%,显著低于非特异性对照EAMMH-r Ad-EGFP(0.76%±0.25%)(p0.05);EAMMH-r Ad-m IL-28B组小鼠分泌IFN-γ的脾细胞数较对照组无明显升高;与EAMMH组比较,EAMMH/r Ad-m IL-28B组的Ig G1水平有增高趋势,而Ig G2c水平降低(p0.05)。研究结论砂生槐种子生物碱中抗虫活性较强的是低极性的水溶性生物碱E2-a,其主要化学成分为苦参碱和槐果碱(68.5%)。E2-a抗包虫的机制为损伤囊泡、诱导CD4+T细胞增多、下调T细胞表面负调节分子PD-1的表达、调节IFN-γ和IL-4,促进免疫功能。E2-a能够影响秀丽隐杆线虫行为能力,降低生殖能力,缩短寿命,影响发育。E2-a对培养的肝细胞株和小鼠的肝肾细胞有轻微毒性效应。IL-28B可下调Treg细胞,但不增强Th1免疫反应,尚需进一步研究其在包虫治疗中的作用。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5

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