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《兰州大学》 2017年
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院内感染细菌16S rDNA基因分型高分辨熔解曲线方法的建立

王倩  
【摘要】:目的建立院内感染常见9种细菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌16S rDNA基因的聚合酶链式反应-高分辨率熔解曲线(PCR-HRM)的分子分型方法,并收集包含在上述9种菌内的25株院内感染细菌临床分离株进行PCR-HRM方法临床验证。方法从文献中检索16S rDNA基因V1、V3、V6、V9高变区引物,收集9种院感细菌的标准株,使用上述引物扩增这9种菌对引物进行验证;扩增V3-V6区测序,测序结果上传Genbank进行同源性比对和分析,确定本实验所用的标准菌型别与Genbank中所报道的细菌种属一致;对9种院感细菌标准株的16S rDNA基因V1、V3、V6、V9可变区进行PCR-HRM,并根据以上各可变区的HRM熔解曲线形状和Tm值差异建立亚组分析决定树方法,分步对院内感染常见的9种细菌鉴别;收集已确定为院内感染细菌并包含在上述9种菌的临床分离株25株,使用本实验建立的亚组分析决定树方法进行盲法鉴定,鉴定结果与微生物表型鉴定结果进行比较。结果(1)可使用V3、V6、V9区引物扩增9种菌的目的产物,V1区引物只能用于扩增4种革兰阳性菌(表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌);本实验所用的菌株与Genbank中其相应模式菌的相似性为99%-100%,可认为所选用菌株的种属无误。(2)根据9种院感细菌标准株的16S rDNA基因V1、V3、V6、V9可变区的PCR-HRM结果,建立了亚组分析决定树方法:(1)在V1区鉴别革兰氏阳性菌和阴性菌:4种革兰氏阳性菌在V1区有目的产物,5种革兰氏阴性菌无目的产物;(2)4种革兰阳性菌鉴别:在V9区鉴别葡萄球菌(表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)和肠球菌(粪肠球菌和屎肠球菌):葡萄球菌和肠球菌在V9区按Tm值不同分成两群(葡萄球菌平均Tm=88.20℃;肠球菌平均Tm=89.75℃);在V3区鉴别两种葡萄球菌:两种葡萄球菌在V3区熔解曲线形状不同;在V1区鉴别两种肠球菌:两种肠球菌在V1区内Tm值相差较大(屎肠球菌Tm=85.74℃;粪肠球菌Tm=86.94℃);(3)5种革兰氏阴性菌鉴别:5种菌在V3区按照熔解曲线形状和Tm值的差异分成3群,包括1群(肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌),2群(阴沟肠杆菌和大肠埃希菌),3群(铜绿假单胞菌);3群的熔解曲线为双峰,且Tm值较高,可在V3区直接区分;在V6区鉴别1群细菌:两种菌在V6区Tm值差异明显(肺炎克雷伯菌Tm=86.20℃;鲍曼不动杆菌Tm=84.84℃);混熔鉴别2群细菌:2群细菌在4个可变区的Tm值和曲线形状差异均不明显,因此设置大肠埃希菌为参考菌株,选择V6区为扩增区,与阴沟肠杆菌V6区扩增产物混熔,结果显示为双峰。(3)25株临床分离株的验证结果显示,22株细菌的HRM鉴定结果与微生物表型鉴定结果一致,1株鉴定结果不一致(HRM鉴定为金黄色葡萄球菌,微生物表型鉴定结果为表皮葡萄球菌),2株无法使用亚组分析决定树分组。结论利用PCR-HRM技术建立了院内感染常见9种细菌鉴定的亚组分析决定树方法;使用亚组分析决定树方法对9种院感细菌临床标本鉴定的准确率为88%(22/25)。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R440

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