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《兰州大学》 2017年
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ALA-PDT对SZ95人皮脂腺细胞活力及内质网应激凋亡信号通路的影响

马燕雪  
【摘要】:痤疮(acne)是一种毛囊皮脂腺慢性炎症性皮肤病,为最常见的皮肤病之一。好发于青少年,发病率高达80%左右。是最常见的毁容性皮肤病,对患者的身心均有较大的影响。其中皮脂腺炎症及皮脂分泌过多是痤疮发病的一个重要环节。ALA-PDT(5-氨基酮戊酸+红光光动力)治疗痤疮已有效应用于临床多年,但其作用机制尚不明确。鉴于此,本研究选用生物学特征与人正常皮脂腺细胞相近的SZ95人皮脂腺细胞作为研究对象,以GRP78、CHOP、Caspase-12为指标。研究ALA-PDT对该细胞ERS凋亡信号通路的影响,为进一步阐明ALA-PDT治疗痤疮的作用机制,研究结果将为ALA-PDT治疗痤疮提供理论依据。目的:1.明确ALA-PDT作用于SZ95人皮脂腺细胞的ALA安全有效浓度及红光辐照剂量;研究ALA-PDT作用该细胞后检测ERS标志分子GRP78及ERS凋亡相关标志性分子CHOP、Caspase-12的调节作用。2.明确毒胡萝卜素(TG)引起ERS的安全有效浓度;检测ERS标志分子GRP78、CHOP、Caspase-12来证明TG诱导该细胞发生ERS;3.明确ALA-PDT对已被TG作用后的该细胞细胞活力及ERS标志性分子GRP78及凋亡相关标志性分子CHOP、Caspase-12的影响。方法:1 MTT法分别筛仅有ALA、仅有红光及ALA-PDT的安全有效ALA浓度及红光剂量。ALA和红光实验均分为空白对照组和实验组,均设调零孔(无细胞,仅加培养基)。ALA组分别给予不同浓度的ALA溶液;红光组分别给不同剂量的红光辐照,时间均为20min;对照组和调零孔仅加培养液。ALA各组及调零孔均避光孵育2h后换液;红光实验组仅红光组给予不同剂量的红光辐照,其他组不做处理仅换液,后均继续培养24h。ALA-PDT实验分两组:空白对照组和ALA-PDT组,设调零孔。ALA-PDT组先用相应浓度的ALA避光孵育2h,后给予相应剂量的红光辐照20min,对照组、调零孔均不处理。辐照后继续培养24h。最后均用MTT法检测ALA的安全有效浓度及红光的安全有效剂量。ALA为25μg/mL+红光为5J/cm2组成的ALA-PDT实验组作用细胞24h后,提取mRNA。用qRT-PCR法检测GRP78、CHOP及Caspase-12mRNA的表达。2.MTT法筛选TG的安全有效浓度。实验分为实验组及空白对照组,设调零孔。不同浓度的TG作用于细胞24h后MTT法筛选安全有效的TG浓度。用0.5μg/mLTG作用于细胞(该浓度细胞存活率与空白对照组间明显差异,但为临界值)24h后提取RNA及蛋白分别用qRT-PCR和WB法检测GRP78和CHOP及Caspase-12mRNA及蛋白的表达。3.MTT法筛TG作用细胞后的ALA-PDT的安全有效浓度及剂量。分为TG对照组(仅加TG)和ALA-PDT组,设调零孔。各组细胞均加0.5μg/mLTG培养24h后,ALA-PDT组先用不同浓度的ALA避光孵育2h,后辐照红光(剂量均为5J/cm2)。其他组处置同前。辐照后继续培养24h,MTT法筛选ALA-PDT组的安全有效浓度及剂量。0.5μg/mLTG作用细胞24h后,用ALA浓度为2.0μg/mL+红光剂量5J/cm2组成的ALA-PDT组作用以上细胞24h后提取细胞RNA及蛋白。用qRT-PCR及WB分别检测GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA和蛋白表达。结果:1.与空白对照组比较,ALA实验组及红光实验组经以上述方法作用后细胞存活率均未见显著性差异,(P0.05),提示单独ALA或红光对SZ95人皮脂腺细胞的存活率无明显影响。与对照组比,ALA-PDT实验组ALA浓度为200、400、800μg/mL时,各剂量红光辐照后细胞存活率均明显下降,有统计学意义(P0.05);ALA溶液为100μg/m L,经≥2.5J/cm2红光辐照,24h后细胞存活率明显降低,有统计学意义(P0.05);当ALA溶液为50μg/mL,经≥5J/cm2红光辐照,24h后细胞存活率明显降低,有统计学意义(P0.05);当ALA溶液为25μg/mL时,≥10J/cm2红光辐照后细胞存活率明显下降,有统计学意义(P0.05);其他ALA-PDT组经以上处理后细胞存活率未见明显改变,(P0.05)。以上结果说明ALA-PDT对细胞存活率的影响有明显的ALA浓度及红光剂量的依赖性。因25μg/mL ALA+5 J/cm2红光组成的ALA-PDT作用于细胞,其存活率与空白对照组相比无明显改变,其又为细胞存活率临界值的条件。用该条件作用细胞后检测GRP78、CHOP及Caspase-12mRNA的表达均明显上调,有统计学意义(P?0.05)。2.与对照组比,TG为0.06、0.125、0.25、0.5μg/mL时细胞存活率与对照组无明显差异(P0.05);TG分别为1、2、4、8μg/mL时,24h后细胞存活率明显下降,有统计学意义(P0.05)。TG浓度为0.5μg/mL时存活率与对照组比无明显改变,但为临界值,该条件作用细胞后GRP78、CHOP及Caspase-12mRNA及蛋白的表达均明显上调,有统计学意义(P0.05)。3.与TG对照组相比当ALA为0.25、0.5、1.0、4、7μg/mL时的ALA-PDT实验组,细胞存活率无明显差异,(P0.05);当ALA为12.5、25μg/mL时的ALA-PDT实验组的细胞存活率明显下降,有统计学意义(P0.05);当ALA为2.0μg/mL时的ALA-PDT细胞存活率明显上调,有统计学意义(P0.05)。因ALA 2.0μg/mL+5J/cm2组成的ALA-PDT实验组对TG诱导发生ERS的该细胞的存活率明显增高,故选该条件的ALA-PDT作用于TG诱导ERS的细胞,结果与TG对照组比GRP78、CHOP和Caspase-12mRNA和蛋白的表达均明显下调。有统计学意义(P0.05)。结论:1.仅有ALA、仅有红光作用于SZ95人皮脂腺细胞,对细胞存活率无明显影响;ALA-PDT作用于该细胞其存活率与ALA浓度及红光剂量有明显相关性。ALA25μg/m L+红光5J/cm2组成ALA-PDT组其不影响细胞存活率,但引起ERS标志分子GRP78及凋亡相关分子CHOP及Caspase-12上调,说明ALA-PDT可诱导该细胞发生凋亡,且ALA浓度及红光剂量越高越明显;2.当TG0.5μg/mL时细胞存活率明显下降。当TG≤0.5μg/mL时细胞存活率无明显影响。当TG为0.5μg/mL时对细胞存活率无明显影响,但可成功诱导ERS;3.当2.0μg/mLALA+5 J/cm2红光组成的ALA-PDT实验组对TG作用后的该细胞的存活率有明显提高作用。其机制可能为:该条件下的ALA-PDT能够抑制ERS通路中相关信号分子GRP78、CHOP和Caspase12的表达。提示该条件ALA-PDT可抑制该细胞发生的ERS,从而起到一定的保护作用。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R758.733

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