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《兰州大学》 2017年
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点阵CO_2激光所致创伤愈合过程提高透明质酸的透皮能力

乔建雄  
【摘要】:目的透明质酸(Hyaluronic acid,HA)已被广泛用于改善皮肤质量、填充皱纹和改善轮廓等美容治疗。我们研究点阵CO2激光作用于皮肤后形成的微通道的愈合过程,并在愈合过程中持续补充HA,研究HA在微创伤愈合过程中透皮能力的变化。方法1.离体皮片制备和点阵CO2能量选择:腹腔注射水合氯醛(0.003m L·g-1)麻醉SD大鼠(下同),电推剪和修眉刀备皮(下同),观察备皮大体效果;取全层皮肤,观察剔除皮下组织前后组织学变化和不同点阵能量的点阵CO2激光作用深度,选择作用于真皮乳头层的能量大小。2.正交试验设计优选点阵密度D、HA分子量Mr、透皮时间T:采用正交设计助手ⅡV3.1设计,分别以D(0、6.3%、11.1%、25.0%)、Mr(10k Da、100k Da、1000k Da、1500k Da)和T(1h、3h、5h、7h)作为考察因素,根据正交表L16(45),得到16组实验组合。3.离体透皮实验:采用改良的Franz扩散池进行SD大鼠离体皮肤透皮试验,用大鼠透明质酸酶联免疫试剂盒(Rat HA ELISA KIT)测定每组接收室内样品液的HA浓度。4.优选试验组合:将3只SD大鼠麻醉、备皮,在脊柱两侧对称部位标记直径约1.50cm的圆圈,左右各三个,两侧从头侧至尾侧依次用不同点阵密度(6.3%、11.1%、25.0%)的点阵CO2激光照射圈内皮肤,在不同时间点观察并记录皮肤反应及愈合情况,结合体外正交试验,优选实验组合“D-Mr-T”。5.在体钙黄绿素染色、HE染色组织学观察及在体HA透皮试验时间点安排:将18只SD大鼠随机分为9组。采用从SD大鼠头侧至尾侧依次标记,一只SD大鼠脊柱左侧依次为0h、6h、12h,脊柱右侧依次为3h、9h、15h;另一只脊柱左侧依次为18h、24h、正常对照组(单纯使用HA),脊柱右侧依次为21h、27h、空白对照组(单纯使用PBS),其中正常对照和空白对照在HA在体透皮试验中使用。使用方法1、4选定的最佳参数的点阵CO2激光(下同)作用于SD大鼠后,0.9%氯化钠溶液无菌湿纱布覆盖,到确定的愈合时间后取开纱布,分别进行在体钙黄绿素染色、HE染色组织学观察及在体HA透皮试验。6.钙黄绿素染色:使用钙黄绿素染色10min,0.9%氯化钠溶液和75%乙醇交替冲洗三遍,拭干表面水分后取全层皮肤剔除皮下组织,立即在荧光显微镜(激发波长490nm,发射波长515nm)下观察,取图记录。另取大小为0.50cm×1.00cm的SD大鼠背部皮肤组织,行HE染色,光学显微镜下观察皮肤创伤愈合变化,取图记录。7.在体HA透皮试验:在对应时间点给予0.50m LHA作用4h后取材,将皮肤和皮下肉膜组织层分开,分别匀浆、离心、取上清液、过滤,采用Rat HA ELISA KIT测定HA浓度。8.统计学分析:使用Excel对体内、体外所有数据建立数据库;使用SPSS19.0软件进行统计学分析;两独立样本间的比较采用t检验,多个样本均数之间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验;P0.05为差异有统计学意义。结果1.离体皮片观察和点阵CO2能量选择结果:离体皮片剔除皮下组织后未见皮下组织残留及皮肤组织缺损,完整保留真皮层。镜下见角质层、表皮层及真皮层层次分明,各层完好无损。点阵CO2激光作用后均形成特征性的微治疗区(microscopic treatment zones,MTZs),并且在其他参数不变的情况下,随能量增大,MTZs深度加深。本研究中选出作用于真皮乳头层的激光能量为30.0m J。2.正交试验设计结果:体外正交试验选择的“D-Mr-T”组合为HA分子量Mr=100k Da、透皮时间4h,点阵密度11.1%和25.0%,点阵密度的最佳参数结合在体反应确定。3.在体皮肤反应结果:点阵密度增大,皮肤反应加重,愈合时间延长。当点阵密度为6.3%时,创面15h愈合,18h后皮肤外观恢复正常;当点阵密度为11.1%时,创面21h愈合,24h后皮肤外观恢复正常;当点阵密度为25.0%时,伤后SD大鼠皮肤边缘开始收缩,形成焦痂,伤后21h创面收缩逐渐减轻,24h时焦痂逐渐开始消失,但27h时仍可见部分焦痂存在。结合体外正交试验结果,本研究实验组合为“11.1%-100k Da-4h”。4.最佳激光参数(能量30.0m J、点阵密度11.1%,下同)的点阵CO2激光作用后钙黄绿素染色结果:可见中空而周围凝固区染色发出强绿色荧光的MTZs。荧光强度随愈合时间延长逐渐变浅。微通道在伤后3h收缩变小,9-12h可见部分微通道中空部分出现染色,21h时微通道荧光光斑处已无明显中空部分,24h时已无明显的荧光光斑。微通道在作用后21h时愈合,皮肤连续性恢复。5.最佳激光参数的点阵CO2激光作用后HE染色结果:即刻(0h)可见典型的MTZs,中央组织气化蒸发形成微通道,周围可见组织凝固层,在体皮肤凝固层外围可见炎症反应带。MTZs在作用后3h部分缩小,有向中央缩小和变浅趋势。MTZs在作用后21h连续性恢复,微通道关闭,但作用后27h时MTZs处仍存在组织热凝固层。6.经皮渗透后皮肤组织中HA的含量变化:最佳参数的点阵激光作用可在0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h使进入皮肤组织的HA含量分别较空白对照组增加约1.62、1.54、1.45、1.38、1.28、1.18、1.12、1.07倍(P0.05),呈递减趋势,而24h、27h组皮肤内HA的含量与空白对照组相同(P0.05)。正常对照组皮肤HA含量与空白对照组相同(P0.05)。7.经皮渗透后肉膜中HA的含量变化:与空白对照组比较,最佳参数的点阵CO2作用后0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、27h后给予外源性HA,皮下肉膜层HA的含量没有变化(P0.05)。结论1.较低能量(≤30.0m J)及点阵密度(≤11.1%)的点阵CO2激光所致微创伤在24h内修复。2.点阵CO2激光作用后100k Da的HA透皮量增加,并且随着微创伤的愈合,其透过量逐渐减少,直到21h后,微创伤愈合,HA无法经皮渗透。3.在一定范围内,随点阵激光能量增大,作用深度加深;随点阵密度增大,HA经皮渗透量增加。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R62

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