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《兰州大学》 2017年
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基于网络方法探讨miRNA在脑肿瘤中的作用机制及应用价值

代军强  
【摘要】:背景:颅内肿瘤又被称为脑肿瘤或者颅脑肿瘤,指发生于颅腔内的神经系统肿瘤,分为恶性肿瘤和良性肿瘤。根据2016年WHO中枢神经系统分类概述将其分为:胶质瘤;室管膜肿瘤;脉络从肿瘤;神经元和混合性神经元-胶质瘤;松果体区肿瘤;胚胎类肿瘤;如髓母细胞瘤;颅神经和椎旁神经肿瘤;脑膜瘤;间叶,非脑膜皮型脑膜瘤;黑色素细胞肿瘤;淋巴瘤;生殖细胞肿瘤;鞍区肿瘤;转移瘤等。其中胶质瘤又可以根据组织细胞来源分为:弥漫性星形细胞和少突胶质细胞瘤;其他星形细胞肿瘤;室管膜肿瘤;其他胶质瘤;神经元和混合性神经元-胶质瘤等不同的类型。根据2016年最新的中枢神经系统肿瘤分类建立了分子时代CNS肿瘤诊断的新概念。结合基因特征,调整部分胶质瘤和髓母细胞瘤的的诊断。将IDH-突变型、IDH-野生型、H3 K27M-突变、IDH-突变和1p19q联合缺失等基因特征加入胶质瘤分级标准中。髓母细胞瘤在传统的组织学分类如典型的髓母细胞瘤、多纤维性/结节增生性髓母细胞瘤、广泛小结节性髓母细胞瘤、大细胞性髓母细胞瘤、非特指性髓母细胞瘤的基础上引入分子病理特征,将WNT活化型、SHH活化型和TP53突变型、SHH活化型和TP53野生型、非WNT/非SHH活化型等分子病理特征应用于髓母细胞瘤的分类和诊断中。III级胶质瘤作为中枢神经系统恶性脑肿瘤,主要分为间变型星形细胞瘤,IDH-突变型、间变少突神经胶质瘤,IDH-突变和1p19q联合缺失型、间变型多形性黄色星形细胞瘤、间变型节细胞胶质瘤。微小RNA(microRNA,miRNA)是存在于植物、动物和一些病毒中小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸),其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。虽然大多数miRNA位于细胞内,但也已经在细胞外环境中发现了一些通常称为循环mi RNA或细胞外miRNA的miRNA分子,包括各种生物体液和细胞培养基。miRNA是RNA干扰的小内源性介质,并且是有机体发育,细胞专一化和体内平衡所需的许多生物过程的关键调节组分。miRNA的表达与许多严重疾病的生理以及病理过程相关,其中包括脑肿瘤。目前尚不清楚miRNA是否与肿瘤的级别、分子亚型的特异性以及肿瘤的预后有关。到目前为止,已经在几乎所有种类的生物体液中发现了微小RNA,包括脑脊液(CSF)。许多研究已经显示在中枢神经系统(CNS)肿瘤患者的组织以及体液中有异常表达的mi RNA,并且有学者提出miRNA可以作为中枢神经系统肿瘤生物标志物。目的:(1)通过加权基因通表达网络(WGCNA)以及cytoscape软件构建III级胶质瘤的无尺度共表达网络,探讨其发生机制,寻找关键基因;(2)结合样本的临床数据,找到与预后相关的miRNA和基因;(3)通过分析髓母细胞瘤差异表达的mi RNA,基于Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件识别髓母细胞瘤潜在的调控网络以及髓母细胞瘤发生发展过程中的关键信号分子;(4)基于生物信息学算法,筛选出颅内常见肿瘤脑脊液中差异表达的miRNA。通过聚类分析,找到可以鉴别脑膜瘤、低级别胶质瘤、胶质母细胞瘤、转移瘤、髓母细胞瘤以及淋巴瘤的的miRNA,选取部分miRNA分子通过荧光定量PCR技术验证其可靠性,从而挖掘mi RNA在脑肿瘤临床术前诊断中的应用价值。方法:(1)使用TCGA-Assembler下载TCGA数据库3级RNASeqV2基因表达数据,miRNA-seq数据以及样本的临床信息。去除表达量接近零的数据,找到正常组与III级胶质瘤差异表达的基因(different expression genes,DEG)和miRNA,使用R软件(3.3.0)中的“DESeq”包来鉴定foldChange2.0且调整的P值0.05的差异表达基因(DEG)和miRNA。通过加权基因通表达网络(WGCNA)以及cytoscape软件构建III级胶质瘤的无尺度共表达网络,并通过基因功能GO富集以及KEGG通路分析探讨其发生机制以及关键基因;(2)通过整合样本的临床数据,找到与预后相关的临床标志物;(3)从NCBI GEO数据库下载髓母细胞瘤mi RNA矩阵文件并执行log2变换。使用线性模型和Bayes检验计算差异表达基因(DEG)。利用热图,可视化差异表达基因。将差异表达的miRNA导入到IPA(Ingenuity Pathway Analysis)软件,使用microRNA Target Filter找到靶向信息。然后使用IPA核心分析模块分析差异表达microRNA相关的网络功能;(4)从GEO数据库下载中枢神经系统肿瘤脑脊液的miRNA表达谱数据,并通过R语言的limma包进行归一化并且寻找差异表达基因(DEG)。通过聚类分析,找到可以正确聚类样本的mi RNA分子。最后,留取兰州大学第二医院神经外科临床中心肿瘤患者的脑脊液标本,通过设计选定的miRNA分子,设计特异性引物,通过荧光定量PCR验证标志物的可靠性。结果:(1)数据结果显示在III级胶质瘤中,有2036个差异表达的mRNA和50个mi RNA,并且,2036个差异基因可以聚类为5个模块,这些模块主要与细胞周期、有丝分裂、微管蛋白的结合、递质传导运输以及p-53信号通路等有关。如在网络中所示,BUB1B,KIFC1,TOP2A,BUB1,SLC12A5,ESCO2,ESPL1,EPR1,KIF15,CASC5,SGOL1,NUSAP1,CCNB2,NUF2,TTK,KIF2C在共表达网络的中心。并且,BUB1B,KIFC1,TOP2A,BUB1,ESPL1,EPR1是过表达基因网络的中心;SLC12A5,VSNL1,SULT4A1,TMEM130,SNAP25位于低表达基因网络的中心。利用差异表达的mRNAseq和miRNAseq数据建立共表达网络,SLC12A5,MAL2,VSNL1,A2BP1,EPB49,SULT4A1,TMEM130,ADAM11,SNAP25,C1orf115,DNM1,SYT1位于网络的中心,并且mir-128,mir-129也参与其中。我们可以假设网络中心的基因就是关键基因并参与III级胶质瘤的重要病理过程;(2)根据样本的临床数据以及标准化后的基因表达数据,我们发现KIF4A,NCAPG,SGOL1,KLK7,SULT4A1和TSHR等基因与预后密切相关。Mir-10b,mir-27a,mir-329-1和mir-138-2等miRNA分子也与III级胶质瘤的预后密切相关;(3)根据GEO数据库的miRNA矩阵数据,我们发现髓母细胞瘤中48个显着差异的表达mi RNA。IPA核心分析显示髓母细胞瘤中28个差异表达的mi RNA与“有组织损伤和异常,生殖系统疾病,癌症”调控网络相关,并且TP53,AGO2,ERK1/2,SIRT1和YBX1基因在髓母细胞瘤的发生发展过程中起到了重要作用;(4)根据脑脊液miRNA芯片分析,mir-205,mir-664和mir-148可以作为生物标志物来区分转移与其他颅内肿瘤。MiR-21,miR-16,mi R-125b,miR-223和miR-142-3p在胶质母细胞瘤患者脑脊液中上调。Mi R-451,mi R-142-3p,miR-25,miR-15a,mi R-16和miR-144在低级别胶质瘤患者脑脊液中高度上调。我们认为mir-21,mir-16在许多恶性脑肿瘤中上调,与低级胶质瘤相比,mir-125b可以是胶质母细胞瘤或差的预后胶质瘤的特异性生物标志物。相对于正常和其他癌症组,miR-711和mir-886-3p在原发性中枢神经系统淋巴瘤中下调。与正常组相比,淋巴瘤组具有更低表达水平的miR-711。此外,与胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤相比,mir-886-3p在淋巴瘤组中下调。结论:(1)生物信息学分析为高级别胶质瘤机制的研究提供了一种新的研究方法;(2)临床预后研究应该是多维度的,尤其是恶性肿瘤的预后不仅与样本的病理分级有关,更重要的是与特殊的分子或者基因标志物密切相关,并且这些信号分子可能在恶性肿瘤的发生和发展过程中起了重要作用;(3)髓母细胞瘤中,miRNA可能通过作用于TP53、AGO2、ERK1/2、SIRT1和YBX1在髓母细胞瘤的发生发展中起了重要作用;(4)MiRNA具有作为中枢神经系统肿瘤非侵入性检测标志物的巨大潜力。但是,目前的microRNA标志物还不能做出准确的诊断。mi RNA测定似乎在淋巴瘤和转移性脑癌的诊断中比在胶质瘤和其他颅脑肿瘤中更敏感。一方面,仍需要基于更大样本量的实验进行更进一步的验证。另一方面,随着二代测序技术的发展,将出现新mi RNA分子以提高CNS疾病诊断的准确性和可靠性。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R739.4

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