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《兰州大学》 2017年
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miR-218靶向调控HMGB1-RAGE通路抑制胶质瘤发生发展机制研究

牛亮  
【摘要】:背景:脑胶质瘤是脑中最常见的恶性肿瘤,具有快速浸润性生长和术后高复发率的特点。低级别胶质瘤患者(世界卫生组织WHO I级和II级)的5年生存率约为30%至70%,而高级别胶质母细胞瘤(IV级)的中位生存期为9至12个月。因此,有必要确定这种恶性疾病更多的生物标志物和潜在的治疗靶点。微小RNA(microRNA,miRNA)涉及一系列重要的生物过程,如细胞发育,分化,凋亡和增殖。异常mi RNA表达与各种肿瘤的发生和进展相关。此外,表达失调的mi RNA可作为诊断和评估预后的生物标志物。目的:研究miRNA在不同级别胶质瘤中的差异表达情况,探讨miRNA通过靶基因调控胶质发生发展的分子机制。方法:(1)利用生物信息学对NCBI GEO数据库内胶质瘤数据分析得出差异表达mi RNA,对22例胶质瘤组织标本通过PCR Array(内含184miRNA引物预设计的PCR芯片)方法筛选胶质瘤内差异表达mi RNA,选取在胶质瘤内表达差异倍数高的mi RNA探讨其在胶质瘤内的调节机制,并通过生物信息学软件预测所选取mi RNA的靶基因进行下一步研究。(2)对66例胶质瘤组织标本及26例正常脑组织标本中,通过荧光定量PCR检测mi R-218在正常脑组织及胶质瘤内表达量,分析miR-218在不同级别胶质瘤内表达情况及表达差异。(3)应用半定量PCR初步检测HMGB1和RAGE基因水平在不同级别胶质瘤内表达情况,在此基础上通过定量PCR对HMGB1和RAGE基因水平在正常脑组织及胶质瘤内表达情况进行验证,分析HMGB1和RAGE在正常脑组织及不同级别胶质瘤内表达情况及表达差异。(4)利用免疫组织化学方法对HMGB1和RAGE在蛋白水平表达量进行检测,分析其在正常脑组织及胶质瘤中阳性细胞表达情况及表达差异,通过蛋白印迹实验检测HMGB1和RAGE的在正常脑组织及胶质瘤中表达量。(5)收集纳入研究患者临床资料并进行随访。通过Kaplan-Meier方法和Cox回归分析患者的生存曲线,进行单变量及多变量Cox回归分析以检查每个临床协变量及mi R-218、HMGB1、RAGE在胶质瘤内表达强度对患者存活的影响。结果:(1)通过对22例胶质瘤组织标本进行PCR Array分析,筛选出明显具有表达差异(Fold Difference2)的miRNA 11个,(miR-22-3p、miR-363-3p、mi R-451a、mi R-20b、miR-450、mi R-149-5p、mi R-15b、miR-106b、miR-148a、mi R-93、miR-218-5p)。通过对NCBI GEO数据分析,获取在胶质瘤明显具有表达差异(Fold Difference4)的miRNA 7个,(miR-7、miR-10b、miR-20b、mi R-551b、miR-455、mi R-218-5p、miR-137)。依据其表达差异选取miR-218为研究对像并利用生物信息学预测mi R-218靶基因HMGB1、RAGE。(2)miR-218在正常脑组织及胶质瘤内均有表达,在不同级别胶质瘤内mi R-218的表达量各不相同。与正常脑组织内miR-218表达量相比较,miR-218表达量与肿瘤等级呈现逆相关。miR-218在高级别(Ⅲ级和Ⅳ级)胶质瘤组织中的表达量明显低于低级别(Ⅰ级和Ⅱ级)(p0.01)。(3)PCR、免疫组织化学染色、蛋白印迹实验检测表明在正常脑组织标本中和不同级别胶质瘤组织标本内均能检测到HMGB1、RAGE表达,HMGB1、RAGE表达量与肿瘤级别正相关,HMGB1、RAGE在高级别(Ⅲ级和Ⅳ级)胶质瘤组织中的表达量明显高于低级别(Ⅰ级和Ⅱ级)(p0.05)。(4)Kaplan-Meier曲线显示低mi R-218表达患者的生存时间显著短于mi R-218高表达的患者,Kaplan-Meier曲线显示HMGB1、RAGE低表达组生存时间长于高表达组。(5)单因素分析显示miR-218低表达与性别(p=0.013),肿瘤大小(p=0.020),WHO分级(p0.001)和KPS评分(p0.001)显着相关,但与患者年龄以及切除程度无关。(6)Cox回归单变量分析显示肿瘤大小(p=0.018),WHO分级(p0.001),mi R-218表达水平(p0.001)为总生存时间(OS)的独立相关因素;肿瘤大小(p=0.045),切除范围(p=0.028),WHO分级(p0.001),miR-218的表达(p0.001)为无进展生存时间(PFS)的独立预后因子。Cox回归多变量分析显示mi R-218的表达(HR=0.32;95%CI 0.11,0.89;p=0.029),切除范围(HR=0.11;95%CI 0.03,0.37;p0.001),肿瘤大小(HR=0.39;95%CI 0.14,1.11;p=0.029),和WHO分级(HR=8.94;95%CI 0.11,1.94;p0.001)是总生存时间(OS)的独立预后因子;miR-218的表达(HR=0.46;95%CI 0.18,1.21;p=0.011),切除范围(HR=0.09;95%CI 0.02,0.30;p0.001),肿瘤大小(HR=0.53;95%CI 0.19,1.45;p=0.031),和WHO分级(HR=2.10;95%CI 1.52,2.91;p0.001)是无进展生存时间(PFS)的独立相关因素。结论:PCR Array及生物信息学筛选出miRNA-218在胶质瘤差异表达,在胶质瘤内表达呈下调趋势。生物信息学预测胶质瘤内HMGB1、RAGE为mi R-218潜在的靶基因。实验检测mi R-218、HMGB1及RAGE结果表明:miR-218可作为胶质瘤中的肿瘤抑制miRNA;miR-218在胶质瘤中下调表达并与HMGB1和RAGE表达呈负相关;mi R-218低表达与HMGB1、RAGE高表达预测胶质瘤患者的预后不良;miR-218能通过调节HMGB1-RAGE的表达抑制胶质瘤的进展。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R739.41

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