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《兰州大学》 2017年
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艰难梭菌特异性鸡卵黄抗体的制备及初步应用

樊俏荣  
【摘要】:目的制备艰难梭菌特异性鸡卵黄抗体(IgY),研究其对艰难梭菌相关腹泻(CDAD)模型小鼠的治疗作用并探究相关的机制,以期探索出一种新的治疗艰难梭菌感染(CDI)的非抗生素方法,同时为CDI诊断试剂及疫苗的研制提供理论依据。方法(1)艰难梭菌特异性鸡IgY的制备及鉴定:将艰难梭菌VPI 10463进行厌氧增菌培养,离心收集菌体,0.4%甲醛脱毒,调节菌体浓度至1×10~9CFU/ml制备为艰难梭菌菌体疫苗。选取8只16周龄健康的海兰产蛋鸡,适应性饲养3周后进行基础免疫,2周后免疫第二针;第3针起进行加强免疫,每2周免疫1次,共免疫2次;第5针起直接用艰难梭菌菌体疫苗进行免疫,每4周免疫1次,共免疫4次。初次免疫1周后开始收集鸡蛋,每隔2天收集1次,留取免疫前的鸡蛋作为阴性对照。联合采用水稀释、硫酸铵盐析和分子筛层析的方法制备艰难梭菌特异性鸡IgY。考马斯亮蓝G-250法测定特异性IgY的蛋白浓度;SDS-PAGE对特异性IgY的分子量及纯度进行分析鉴定;间接ELISA法测定特异性IgY的抗体效价及理化性质。(2)艰难梭菌特异性鸡IgY对艰难梭菌的影响:细胞粘附实验研究特异性IgY对艰难梭菌粘附作用的影响;生长抑制实验检测特异性IgY的体外抑菌作用;细胞毒性中和实验研究特异性IgY对艰难梭菌毒素毒性作用的影响。(3)艰难梭菌特异性鸡IgY对CDAD模型小鼠的治疗作用:建立BALB/C小鼠CDAD模型,选取30只CDAD小鼠,随机分为5组,每组6只,以11.86mg/m L、1.19mg/mL、0.12mg/mL特异性IgY灌胃,0.5mL/只,1次/d,连续灌胃3d,同时设立CDAD模型组(灌胃生理盐水)及阴性对照组(灌胃阴性对照IgY)。末次灌胃24h后处死小鼠,取一部分盲肠组织中段制作病理切片;其余盲肠组织进行DAO、D-乳酸和TNF-α含量测定;从回盲部取3cm回肠组织测定肠组织含水率。结果(1)经测定最终获得的特异性IgY的蛋白浓度为11.86mg/ml;SDS-PAGE显示,特异性IgY由重链(H链)和轻链(L链)组成,H链的分子量为68kDa,L链的分子量为38kDa,纯度为电泳纯;间接ELISA法测得特异性IgY的抗体效价为1:8192。特异性IgY在63.5℃以下处理2h,抗体效价基本保持稳定,70℃处理2h后,仍能保留一定的抗体活性,但当温度80℃时,抗体完全失活;特异性IgY在酸性条件下抗体效价无明显变化。(2)粘附实验显示,中、高剂量IgY组Lovo细胞的艰难梭菌粘附数量均显著低于低剂量IgY组、空白对照组和阴性对照组(P0.01);低剂量IgY组Lovo细胞的艰难梭菌粘附数量均显著低于阴性对照组和空白对照组(P0.05)。生长抑制实验显示,各剂量组间艰难梭菌生长曲线比较无显著差异(P0.05)。细胞毒性中和实验显示,特异性IgY对TcdA细胞毒性的中和效价为2.2×2~7 CU/mg,对TcdB细胞毒性的中和效价为2.0×2~7 CU/mg。(3)盲肠组织病理结果显示:阴性对照组和CDAD模型组小鼠盲肠黏膜脱落伴大量炎性细胞浸润;高剂量IgY治疗组小鼠盲肠黏膜完整,未见炎性细胞浸润;中剂量IgY治疗组小鼠盲肠黏膜少量炎性细胞浸润;低剂量IgY治疗组小鼠盲肠黏膜上皮细胞脱落,少量炎性细胞浸润。(4)肠道屏障功能及炎性细胞因子的检测结果表明,高剂量IgY治疗组小鼠盲肠组织DAO活性均显著高于CDAD模型组和阴性对照组(P0.01);中剂量IgY治疗组小鼠盲肠组织DAO活性显著高于阴性对照组(P0.05);中、高剂量IgY治疗组小鼠盲肠组织TNF-α含量均显著低于低剂量IgY治疗组、CDAD模型组和阴性对照组(P0.05);各剂量组间小鼠回肠组织含水率及盲肠组织D-乳酸含量比较无显著差异(P0.05)。结论(1)以灭活艰难梭菌菌体疫苗为抗原免疫海兰产蛋鸡,首次成功纯化获得了高浓度、高纯度、高效价以及理化性质稳定的艰难梭菌特异性鸡IgY。(2)特异性IgY可显著抑制艰难梭菌对肠上皮细胞的粘附,并能有效中和艰难梭菌毒素,可能是特异性IgY发挥CDI防治作用的基础。(3)口服特异性IgY能有效改善艰难梭菌感染引起小鼠盲肠黏膜上皮细胞损伤,减轻肠道的炎症反应,对CDAD具有良好的治疗作用。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R392

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