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《兰州大学》 2017年
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高效合成低分子量透明质酸工程链球菌的遗传构建及发酵工艺研究

陆剑飞  
【摘要】:透明质酸是一种由葡萄糖醛酸与N-乙酰葡糖胺组成的高聚合线性多糖分子。透明质酸可以有效结合自身质量500倍以上的水分子,具有极强的保水性能,因此,该物质常在化妆品中作为保湿剂使用,尤其是低分子量透明质酸与透明质酸寡聚体在医疗行业具有更广泛的用途。然而,如何高效、低成本的获得低分子量透明质酸与透明质酸寡聚体尚是一个难题。本论文通过对兽疫链球菌透明质酸合成代谢途径进行遗传工程改造和菌株诱变筛选获得了低分子量透明质酸生产性能较好的工程菌株。通过对筛选获得的工程菌株发酵条件进行优化以及在发酵过程中添加外源透明质酸酶处理,最终形成了一套高效、低成本地获得低分子量透明质酸与透明质酸寡聚体的方法,获得了以下研究成果:1、通过遗传改造构建了在兽疫链球菌中重组表达颤藻血红蛋白的工程兽疫链球菌菌株。这有效提升了该菌株对氧气的利用率,使得菌体通过无氧呼吸产生的乳酸大幅度降低,从而提高发酵过程中的碳源利用效率并且最终提升透明质酸产量。2、对重组表达颤藻血红蛋白兽疫链球菌工程菌株发酵条件进行优化,结果表明,在发酵中期通过流加补料蔗糖可以有效提升发酵液中的低分子透明质酸产量。3、利用NTG对重组表达颤藻血红蛋白菌株SZ002进行诱变、利福平筛选最终获得了一株透明质酸酶缺失突变型菌株(SZ042)。该菌株具有较高的产低分子量透明质酸的能力。通过发酵条件优化发现该菌株发酵过程中对碳源的需求度相对较低,仅为野生型兽疫链球菌1/2。另外,当发酵过程中补料的碳源中蔗糖与麦芽糖的比例为3:1时,该菌发酵产生的透明质酸产量更高。4、为了进一步提升兽疫链球菌合成低分子量透明质酸的能力,本研究从SZ042出发,构建了可以在锌离子诱导条件下共表达透明质酸合成酶HasA、HasD以及HasC的工程菌株。该菌株在受到锌离子诱导时大量表达HasA、HasD以及HasC,从而提升了菌体合成低分子量透明质酸的能力;并可以有效平衡HasD与HasC在体内的含量从而降低透明质酸合成过程中的能量消耗。5、采用重组乳酸克鲁维酵母分泌表达水蛭透明质酸酶,其发酵上清液中可检测到6×10~4U/ml透明质酸酶活性。将该透明质酸酶按照100U/L的比例添加入兽疫链球菌发酵液中进行共发酵,可以促使低分子量透明质酸的产量提高到29.5g/L,而该产量是兽疫链球菌原始透明质酸产量的约15倍。综上所述,本研究通过对兽疫链球菌进行遗传工程改造、发酵条件优化、菌株诱变筛选以及发酵过程中添加外源的透明质酸酶处理,开发了一株可以高效、低成本、产低分子量透明质酸的工程菌株。应用该工程菌株可以降低发酵过程中培养基碳源使用量和能源消耗并且提高透明质酸的发酵产量。另外,本研究还开发了一套应用重组水蛭透明质酸酶与兽疫链球菌共发酵的工艺。应用该工艺可以一步获得低分子量透明质酸或透明质酸寡聚体,并且极大地提高透明质酸的产量。本研究获得的遗传工程菌株与建立的相关工艺可以更加高效、低成本地制备低分子量透明质酸或透明质酸寡聚体,为这类分子广泛应用奠定了基础。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ929

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