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《兰州大学》 2018年
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蕨麻多糖干预对镉诱导的神经细胞凋亡和自噬的影响

程菊  
【摘要】:中药有效成分β-细辛醚、丹酚酸B、人参皂苷Rg1、人参皂苷GRb1等均具有抗氧化、抗凋亡、抑制细胞自噬等作用,其效果有助于细胞存活,发挥细胞保护作用。蕨麻具有益气补血、滋补强身、健脾和胃、滋阴养肾之功效,其活性成分蕨麻多糖(potentilla anserine polysaccharide,PAP)具有抗氧化、抗缺氧及免疫调节作用。以PAP抗氧化药效为切入点,探索镉(Cadmium,Cd)的神经毒性和PAP的保护作用是极其必要的。Cd是一种有毒重金属,经消化道、呼吸道或皮肤接触,进入机体成为外源性化学致毒物质。因其生物半衰期可长达10~20年,极易蓄积于体内各组织器官。Cd的致毒性与其理化特性有关,除半衰期长外,还与它的离子半径(97 pm)有关,Ca~(2+)半径99 pm,与Cd~(2+)极为相似。Cd~(2+)进入细胞内可导致Ca~(2+)的结合位点或离子通道被其取代,也可与Zn~(2+)、Fe~(2+)等离子竞争蛋白分子的结合位点或离子通道等损伤组织细胞,引起持续性病理变化。神经毒性是指外源性化学物质引起的中枢神经系统和周围神经结构和功能损害。Cd的神经毒性,首先导致组成血脑屏障的血管内皮细胞、胶质细胞和脉络丛损伤,破坏血脑屏障的完整性及增加其通透性,之后更多的Cd进入中枢神经系统并长期蓄积,导致神经细胞及胶质细胞结构改变、线粒体损伤、DNA断裂、细胞死亡等。现已报道的有关Cd神经毒性的机制,大部分为通过Cd诱导体外培养细胞凋亡的研究,认为Cd的神经毒性主要源于其诱导的氧化应激反应和细胞内钙稳态失衡。氧化应激导致脂质过氧化反应,线粒体双层膜脂质过氧化导致膜结构和功能的改变,如线粒体膜电位变化等,因此线粒体必然成为Cd毒性作用的靶点。Cd竞争性抑制Ca~(2+)通过电压依赖性门控通道的转运,电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)的开关状态,对线粒体膜内外代谢物分子和离子的流动效率产生明显的影响,当VDAC开放时,Ca~(2+)易于经VDAC流入线粒体,从而导致线粒体肿胀、凋亡发生。综上所述,Cd神经毒性作用主要源于其诱导的氧化应激反应和竞争性抑制Ca~(2+)通道,影响线粒体膜及其离子流动。传统藏药蕨麻对各种原因导致的脑缺氧性损伤具有保护作用,其机制与清除自由基、抑制氧化应激损伤以及改善线粒体功能密切相关。根据传统医学中的性味功效和现代药理学分析,蕨麻有可能成为一种新的对抗Cd神经毒性药物。目的:首次选用蕨麻主要活性成分PAP,干预Cd染毒神经细胞和小鼠,探讨Cd对中枢神经系统的毒性损伤机制及其PAP可能的保护作用,为进一步认识Cd的神经毒性作用、预防和治疗Cd中毒以及蕨麻的开发利用提供理论依据。方法:1.选用小鼠脑神经瘤细胞(N2a)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和BALB/c小鼠为实验对象。2.Cd梯度浓度染毒建立细胞和小鼠染毒模型,并确定致毒剂量。PAP梯度浓度给药,选择并确定最有效剂量。3.测定脑体系数、宏观观察动物脑与其他脏器的大体变化;显微和超微观察培养的神经细胞和动物脑细胞的形态变化;CCK-8检测细胞细胞生存率,荧光法和流式细胞术观察并检测细胞核形改变、细胞凋亡率、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)和细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]i);AO和MDC染色观察细胞酸性自噬泡和晚期自噬溶酶体。比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H_2O_2)含量、Na~+K~+-ATPase、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATPase及总ATPase活性;免疫印迹、免疫组化及免疫荧光分析等检测凋亡和自噬相关蛋白表达。结果:1.Cd染毒细胞和动物,除动物出现神经症状及脏器和脑体系数变化外,细胞的凋亡和死亡率增加;PAP干预,染毒动物的症状、肝脾损伤减轻、脑体系数降低,细胞的凋亡和死亡率下降。2.Cd的神经毒性作用与氧化应激有关。ROS水平随Cd浓度的增加而升高,SOD活性显著降低,MDA、CAT、H_2O_2水平均明显增高;PAP干预可使ROS水平下降、MDA、CAT、H_2O_2水平降低,SOD活性上升。结果表明,PAP可抑制Cd神经毒性导致的氧化应激反应。3.Cd染毒细胞和动物[Ca~(2+)]i明显增加,诱导CaMK II、Akt和mTOR磷酸化水平显著增高;PAP干预[Ca~(2+)]i减低,能降低CaMK II、Akt和mTOR磷酸化水平,通过维持细胞内钙稳态,抑制Akt/mTOR信号通路激活,抑制细胞凋亡。4.Cd染毒细胞和动物脑细胞的超微结构变化以核皱缩、碎裂,线粒体嵴模糊、呈空泡状,可见凋亡小体为主。染毒细胞的MMP降低或消失,Na~+K~+-ATPase、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATPase及总ATPase活性降低,凋亡相关蛋白Bcl-2表达下降,Bax表达增高,Bcl-2/Bax比值降低,Cyt C,AIF的表达增高、Cleaved caspase-3蛋白和Cleaved PARP蛋白的表达增加。PAP干预可使细胞超微结构改善,MMP恢复,Na~+K~+-ATPase、Ca~(2+)Mg~(2+)-ATPase及总ATPase活性增加,Bcl-2/Bax比值上升,Cyt C、AIF的表达增高、Cleaved caspase-3蛋白和Cleaved PARP蛋白的表达增加,表明PAP能激活神经细胞的抗凋亡蛋白,抑制caspase依赖性凋亡途径和caspase非依赖性凋亡途径,从而抑制细胞凋亡。5.Cd染毒细胞和动物脑细胞的超微结构可见大量的自噬泡,Cd染毒细胞AVOs、自噬溶酶体增多,FJB染色定性变性细胞增多。Bcl-2、p62蛋白表达水平显著降低,PI3K class III、Beclin-1、LC3 II表达水平显著升高;动物脑组织也出现相应的蛋白变化,而且LC3免疫荧光分析显示小鼠皮质和海马CA1、CA3及Hilus区神经细胞中LC3在核周点状聚集较对照组显著增加,且在海马区CA3CA1Hilus区。PAP干预,能显著减少酸性自噬泡形成及改善胞质空泡化,增高Bcl-2和p62表达,降低PI3K class III、Beclin-1及LC3 II的蛋白水平,同时抑制LC3 I向LC3 II的转化,联合使用自噬抑制剂LY 294002效果更佳。结论:1.Cd对神经细胞和小鼠脑细胞均具有毒性作用,PAP能拮抗Cd诱导的神经毒性。2.Cd神经毒性源于氧化应激反应和细胞内钙离子稳态失衡,PAP可抑制氧化应激反应,稳定细胞内钙离子平衡。3.Cd神经毒性以细胞凋亡及自噬性死亡为主,PAP的保护作用与抑制凋亡及自噬性死亡密切相关。4.Cd神经毒性诱导凋亡的途径可能是线粒体介导的Caspase依赖性和Caspase非依赖性凋亡途径,以Akt/mTOR信号通路调控细胞凋亡为主。PAP的抗凋亡作用与稳定细胞内钙离子平衡、保护线粒体膜等作用有关。5.Cd神经毒性诱导细胞自噬的途径可能是PI3K III/Beclin-1信号通路,PAP通过调节自噬相关因子抑制细胞自噬性死亡。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R595.2

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【参考文献】
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