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《兰州大学》 2019年
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脊髓背角mGluR5/ERK信号通路对甘氨酸受体α1~(ins)亚基的特异性调节作用

张子洋  
【摘要】:目的:在成年动物的脊髓背角,由α1亚基构成的甘氨酸受体(Glycine receptors;GlyRs)介导绝大部分的抑制性甘氨酸能突触传递。mRNA的选择性剪接(alternative splicing),会产生一种α1的异构体、即α1~(ins)。然而,α1~(ins)亚基的功能及其调控机制至今却远不清楚。本研究旨在探讨α1~(ins)亚基在脊髓痛觉传递中的作用及其病理学意义。方法:本研究通过免疫共沉淀、GST沉降等方法,鉴定α1~(ins)的分子伴侣;免疫组织化学法研究α1~(ins)在脊髓中的分布;体外培养脊髓背角神经元,通过免疫细胞化学法,研究α1~(ins)的胞内运输(intracellular trafficking)特性;膜片钳电生理学记录法,研究α1~(ins)的电流及其调控;LC-MS/MS方法研究α1~(ins)的磷酸化和泛素化修饰;在福尔马林诱发的炎性疼痛模型动物中,测定动物的痛阈,研究α1~(ins)在病理性疼痛中的作用及其分子机制。结果:(1)α1~(ins)亚基分布于脊髓背角浅层神经元,并定位于抑制性突触后膜,参与甘氨酸受体介导的抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic currents;IPSCs);降低α1~(ins)的表达,会显著减小GlyRs的微小IPSCs(mIPSCs)的幅值、而不影响其频率;(2)α1~(ins)在痛觉的传递与整合中发挥重要作用;shRNA干扰α1~(ins)的表达,会明显提高脊髓背角神经元的兴奋性,上调动物对机械性刺激、热刺激以及冷刺激的敏感性,降低动物的痛阈;(3)α1~(ins)亚基是代谢型谷氨酸受体mGluR5的特异性调控底物;激动脊髓背角mGluR5,会选择性降低α1~(ins)的电流幅值,而对甘氨酸受体α1亚基、α3亚基的电流幅值无明显影响;(4)细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase;ERK)是mGluR5抑制α1~(ins)的关键性信号分子;通过激活下游的ERK,mGluR5降低GlyRs-IPSCs的幅值;病毒转染针对α1~(ins)的shRNA(shRNA-α1~(ins)),会完全消除mGluR5的抑制作用,而转染α3的shRNA(shRNA-α3),却不会对mGluR5mGluR5的抑制功能产生明显的影响;(5)活化的ERK能够特异性结合α1~(ins)亚基,但却不能结合α1、α3以及甘氨酸受体的β亚基;(6)α1~(ins)的第316-334位氨基酸,是结合ERK的关键序列;一段融合了TAT转导肽的、第316-334位氨基酸序列的模拟多肽链(TAT-pep-α1~(ins)),能够剂量依赖性地打断体内外α1~(ins)/ERK的结合;(7)质谱研究结果显示:ERK能够直接催化α1~(ins)的第380位丝氨酸(Ser380)发生磷酸化;(8)Ser380的磷酸化,会易化α1~(ins)的泛素化修饰;(9)第379位的赖氨酸残基(Lys379),是α1~(ins)的主要泛素化位点;(10)泛素化的Lys379,能够结合表皮生长因子受体底物Eps15(epidermal growth factor receptor substrate 15),诱导膜表面α1~(ins)的内陷(endocytosis);(11)外周炎性损伤,通过mGluR5/ERK信号通路,增强ERK与α1~(ins)的结合,提高Ser380的磷酸化水平,抑制α1~(ins)在细胞膜表面的表达,降低GlyRs-IPSCs的幅值,诱发甘氨酸能“去”抑制;(12)在炎性疼痛动物的鞘内注射TAT-pep-α1~(ins),能够抑制ERK对α1~(ins)的Ser380的磷酸化修饰,增强甘氨酸受体的抑制性突触传递,而对兴奋性谷氨酸能突触传递和GABA_A受体介导的抑制性突触传递无明显影响;(13)鞘内注射TAT-pep-α1~(ins),能够抑制mGluR5引发的自发性疼痛,并剂量依赖性地缓解福尔马林诱发的第二相疼痛反应。结论:脊髓背角mGluR5/ERK信号通路特异性下调α1~(ins)亚基介导的抑制性甘氨酸能突触传递;干扰ERK/α1~(ins)的分子结合,能够产生显著的镇痛作用。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R338

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