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《兰州大学》 2019年
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食管鳞癌循环肿瘤细胞和miRNA-506分子的检测及潜在临床应用

李淑萍  
【摘要】:目的食管癌是由于食管腺上皮或者鳞状上皮异常增生、癌变而引起的恶性肿瘤。按照病理类型的不同分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌。在全世界新增食管癌患者中有超过50%来自中国。在中国食管癌患者中,有超过90%的食管癌患者的病理类型为食管鳞状细胞癌。食管癌导致的死亡数在所有癌症中居第四位,而导致食管癌患者死亡的主要原因是肿瘤的转移和局部复发。肿瘤的转移和复发的早期诊断对于改善食管癌患者的预后具有重要作用,目前的诊断方法对于早期食管癌的诊断效果不理想,因此寻找新的对早期食管癌患者及有效的肿瘤转移和复发的诊断方法成为新的研究热点。随着后基因组时代的来临和肿瘤生物标志物的兴起,科研人员对人体血液中组分的细微差异也可以进行检测和探究,进而应用于肿瘤的早期发现和早期诊断,这种血液中的组分差异已成为肿瘤学研究的热点和趋势。本研究通过免疫荧光组织化学和实时荧光PCR的方法分别对食管鳞状细胞患者外周血液中的循环肿瘤细胞(CTCs)和miRNA-506分子进行检测分析,并通过统计学方法分析二者与患者临床病理特征以及预后的关系,旨在为食管鳞状细胞癌的早期诊断提供科学实验基础,为食管鳞状细胞癌临床治疗和降低延缓食管鳞状细胞癌患者的转移和复发提供指导,加快食管鳞状细胞癌的研究进程。方法(1)选择2010年5月-2012年10月之间在兰州大学第一医院就诊,经病理明确诊断为ESCC的140例患者为研究对象,并随机筛选25例身体健康的志愿者作为研究对照组,采集所有入选对象的血液,以CD19作为癌症细胞标志物,以CD45作为正常细胞标志物,采用免疫磁珠分离技术对CD19~+/CD45~-的CTCs细胞进行富集,并利用免疫荧光组织化学法对CTCs进行鉴别。CTCs与ESCC患者临床病理特征的关系采用卡方检验的统计方法。采用Kaplan-Meier方法对ESCC患者进行生存分析。Cox风险比例模型进行多因素分析。主要的结局指标是无病生存时间(disease-free survival,DFS)和总生存时间(overall survival,OS)。应用SPSS19.0统计软件(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计学处理。P0.05为差异有统计学意义。(2)选取2009年1月到2011年12月在兰州大学第一医院接受治疗的100名ESCC患者作为研究对象,随机筛选40例身体健康的志愿者作为研究对照组。采集所有患者的血液;利用qRT-PCR检测血浆样本中miRNA-506含量;采用Mann-Whitney检验比较ESCC患者和健康志愿者之间的血浆中miRNA-506表达的差异。同时采用Mann-Whitney检验比较用不同分期的ESCC患者血浆中miRNA-506水平的差异。受试者工作特征曲线(ROC曲线)被用来评估miRNA-506用于诊断ESCC的效果。卡方检验被用于评估ESCC患者血浆中miRNA-506的表达与临床病理特征之间的关系,ESCC患者的主要临床观察结果由无病生存(DFS)和总生存(OS)两个指标进行指征。ESCC患者的主要临床结局由无病生存(DFS)和总生存(OS)两个指标进行指征。生存分析采用Kaplan-Meier方法,Log-rank检验用于比较两组之间的存活率,采用Cox比例风险模型进行所有协变量的联合效应分析。采用SPSS19.0软件统计数据,以P0.05表示差异有统计学意义。结果(1)25例健康志愿者组成的对照组外周血中未检测出CTCs,ESCC组患者外周血中CTCs检出率为44.3%(62/140),两组CTCs阳性率比较差异具有统计学意义(P0.05);在140例ESCC患者中,根据现行标准得出CTCs阳性患者有62例。在TNM分期的I期ESCC患者中发现CTCs阳性率为11.5%,II期ESCC患者中CTCs阳性率为21.0%,III-IV期ESCC患者中CTCs阳性率为48.4%。ESCC患者中CTCs的阳性率与肿瘤的分期阶段具有显著的相关性(P=0.013),分期越高,阳性率越高。然而,ESCC患者中CTCs阳性率在不同年龄、性别、是否吸烟、是否肿瘤史、肿瘤位置、不同分化程度肿瘤、是否淋巴管浸润以及是否淋巴静脉浸润之间的分布没有显著性差异(P0.05);根据检测结果,将140例ESCC患者分为CTCs阳性组和CTCs阴性组。Kaplan-Meier统计分析结果显示与CTCs阴性患者的无病生存期(DFS)和总体生存期(OS)相比,CTCs阳性ESCC患者的DFS和OS均显著缩短。单因素分析结果显示3年生存率与肿瘤的分化程度、pT、pN、肿瘤分期、淋巴侵袭和CTCs状态显着相关,并且CTCs阴性ESCC患者的3年生存率显著高于CTCs阳性ESCC患者的3年生存率(P=0.013)。多因素分析显示,肿瘤分期和CTCs状态是影响ESCC患者OS和DFS的重要独立因素(P0.05)。(2)ESCC患者血浆中miRNA-506表达的平均水平显著高于健康志愿者血浆中miRNA-506表达平均水平(P0.001);随后将100例ESCC患者分成了几个亚组,结果发现与ECSS TNM I期或II期患者相比,ECSS III期患者血浆中的miRNA-506平均表达水平显著升高(P0.001);与肿瘤直径4cm的ESCC患者血浆中的miRNA-506平均表达水平相比,肿瘤直径4cm的ESCC患者血浆中的miRNA-506平均表达水平显著升高(P0.05)。基于患者血浆中miRNA-506的表达水平,将100例ESCC患者分为miRNA-506高表达组和miRNA-506低表达组。结果表明ESCC患者血浆中miRNA-506的表达水平与淋巴结状态(P=0.004)、TNM分期(P=0.031)和肿瘤直径(P0.001)密切相关,差异均具有统计学意义(P0.05)。但是ESCC患者血浆中miRNA-506的表达与其他ESCC患者临床病理特征无显著关联,差异无统计学意义(P0.05)(表1);ROC曲线分析发现血浆中miRNA-506的曲线下面积为0.835,提示血浆中miRNA-506水平对ESCC诊断有统计学差异(P0.001)。在最佳截止点处,血浆中miRNA-506的水平对ESCC的诊断的敏感性和特异性分别为81.2%和87.3%分别;Kaplan-Meier分析显示与血浆miRNA-506低表达患者的DFS和OS相比,血浆miRNA-506高表达患者的生存时间(DFS和OS)均显著缩短。单因素分析显示T期、N期、肿瘤直径和高miRNA-506表达水平与ESCC患者的DFS和OS显着相关(P0.05)。采用Cox回归模型进行多因素分析显示高miRNA-506表达是影响患者预后不良的独立因素(DFS:HR=2.647,95%CI=1.529-4.582,P=0.001;OS:HR=2.351,95%CI=1.317-4.195,P=0.004)。结论(1)ESCC患者血液中CTCs阳性是一种独立的预后生物标志物,CTCs的出现预示着ESCC患者预后较差。(2)ESCC患者血浆中miRNA-506的高表达与ESCC患者的预后不良密切相关。因此,miRNA-506可作为诊断ESCC患者和预测ESCC患者预后的重要的分子标志物。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R735.1

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