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《兰州大学》 2019年
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TGF-β1介导Smad和MAPK通路在纳米NiO诱导A549细胞胶原形成中的作用

田敏敏  
【摘要】:目的:建立体外培养的人肺腺癌上皮细胞(A549细胞)毒性模型,探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)介导的Smad和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在纳米NiO致A549细胞胶原形成中的作用及其潜在的分子机制。方法:(1)选择处于对数生长期的A549细胞,采用不同浓度的纳米NiO(0、12.5、25、50、100和200μg/ml)分别处理6、12、24、36和48 h;分别采用TGF-β1抑制剂(10μM SB431542)、MAPK信号通路p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)抑制剂(10μM SB203580和10μM U0126)预处理1 h,随后联合100μg/ml纳米NiO再处理A549细胞24 h。(2)用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测纳米NiO对A549细胞存活率的影响,生化试剂盒检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力和羟脯胺酸(Hyp)含量。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液中TGF-β1的含量。(4)RT-qPCR技术检测Smad2、Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、p38、ERK1/2、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)和TIMP-2的mRNA表达水平。(5)Western blot检测I型胶原蛋白(Col-I)、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin、vimentin、fibronectin、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的蛋白表达水平,以及TGF-β受体1(TGF-βR1)、Smad2、Smad3、p38和ERK1/2的总蛋白及其磷酸化水平。(6)细胞免疫荧光实验检测p-Smad3的核转位情况。结果:(1)细胞毒性实验结果显示,随着纳米NiO处理浓度(12.5、25、50、100和200μg/ml)和时间(6、12、24、36和48 h)的增加,A549细胞的存活率呈逐渐下降趋势,且各浓度纳米NiO处理细胞24 h后其存活率均低于对照组(P0.05)。纳米NiO(12.5、25、50、100和200μg/ml)处理A549细胞24 h,各剂量组LDH活力均高于对照组(P0.05)。(2)根据以上细胞毒性实验结果,本研究选择25、50和100μg/ml纳米NiO处理A549细胞24 h,观察纳米NiO对A549细胞胶原形成及信号通路相关基因和蛋白水平的影响。结果发现,100μg/ml纳米NiO组细胞培养基中Hyp含量和细胞中Col-I的蛋白表达水平均高于对照组(P0.05)。ELISA结果显示,随着纳米NiO浓度的增加,细胞培养液中TGF-β1含量增加,其中50和100μg/ml纳米NiO组TGF-β1含量高于对照组(P0.05)。RT-qPCR结果显示,纳米NiO各处理组A549细胞Smad2、Smad3、α-SMA、vimentin、fibronectin、ERK1/2、p38、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达水平均随着纳米NiO浓度的增加而升高,而E-cadherin的mRNA表达随着纳米NiO浓度的升高反而降低,且100μg/ml纳米NiO组上述基因异常表达最显著(P0.05)。Western blot结果显示,随着纳米NiO剂量的增加,TGF-β1、α-SMA、vimentin、fibronectin、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白水平,以及Smad2、Smad3、p38和ERK1/2的蛋白磷酸化水平均逐渐升高,而E-cadherin蛋白表达水平逐渐降低,尤其以100μg/ml纳米NiO组上述蛋白异常表达最显著(P0.05)。免疫荧光检测结果显示,纳米NiO各组A549细胞核中p-Smad3荧光表达均增强,并伴有核固缩和核破碎现象,且以100μg/ml纳米NiO组最明显。(3)根据上述实验结果,本研究选择100μg/ml纳米NiO联合3种抑制剂分别处理A549细胞,探讨纳米NiO诱导A549细胞胶原过量形成的可能机制。MTT结果显示,与纳米NiO组比较,纳米NiO+SB431542、纳米NiO+SB203580和纳米NiO+U0126组各自的细胞存活率均升高(P0.05),而抑制剂SB431542、SB203580和U0126各组的细胞存活率与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。Western blot检测发现,与纳米NiO组比较,纳米NiO+SB431542处理组细胞Smad2、Smad3、p38和ERK1/2的蛋白磷酸化水平以及Col-I、α-SMA、vimentin和fibronectin蛋白表达水平均下降,而E-cadherin表达水平升高(P0.05)。结果表明,纳米NiO诱导A549细胞胶原过量形成与TGF-β1介导的Smad和MAPK信号通路及上皮间充质转化(EMT)发生有关。纳米NiO+SB203580组和纳米NiO+U0126组细胞p38和ERK1/2的蛋白磷酸化水平以及Col-I、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的蛋白表达水平均低于纳米NiO组(P0.05),但SB431542、SB203580和U0126组上述蛋白的表达水平与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结果表明,纳米NiO诱导A549细胞MAPK信号通路活化,进而促使MMPs/TIMPs失衡是纳米NiO诱导A549细胞胶原过量形成的主要原因。结论:纳米NiO可诱导A549细胞胶原过量形成,其机制可能与TGF-β1介导的Smad和MAPK信号通路活化、EMT发生以及MMPs/TIMPs失衡有关。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R114

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