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猪2型链球菌MRP基因的克隆及表达

孙瑜隆  
【摘要】: 猪链球菌(Streptococcus suis S.suis)是一种重要的人畜共患病原体,可引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎及败血症等疾病,亦可引起人类感染,导致脑膜炎及中毒性休克综合征等严重疾患。该菌有33个血清型,其中以2型流行最广、致病性最强。猪链球菌有多种毒力因子,如溶菌酶释放蛋白(MRP),溶血素(SYL),胞外蛋白因子(EF)等,但MRP是该菌最为重要的毒力因子之一。 本研究根据猪2型链球菌溶菌酶释放蛋白编码基因序列,设计并合成1对特异性引物,以猪2型链球菌青海株基因组为模板扩增MRP基因34-813bp片断,并进行T/A克隆,转化大肠杆菌,成功获得目的片断,将目的片段定向克隆到pET-28a(+)组氨酸的下游。用鉴定阳性的重组质粒转化BL21,经IPTG诱导可表达分子量约27kD的融合蛋白。免疫印迹分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。 本研究克隆了猪2型链球菌青海株MRP基因完整的阅读框。编码区长度为3771bp,与已登陆的序列对比发现此基因的阅读框高度保守。将克隆的青海株的MRP基因插入pAdTrack-CMV穿梭质粒,获得了转移质粒pAdTrack-CMV/MRP,对之线性化后,用pAdEasyTM系统,电转化已含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌,经同源重组,获得含有全MRP基因的腺病毒载体pAd/MRP,后者经酶切充分暴露反向末端重复序列后,与脂质体混合转染HEK-293细胞,获得了复制缺陷型重组腺病毒rAd-MRP。RT-PCR检测到重组腺病毒rAd-MRP中MRP基因在转录水平有表达。连续传代和PCR检测表明rAd-MRP在HEK-293细胞中传代稳定。为评价重组腺病毒rAd-MRP的免疫效果,用其免疫28日龄小鼠后,间接ELISA可以检测到特异性抗体,抗体滴度达1:160。


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