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有机磷化合物对视网膜神经细胞损伤及其机制的实验研究

魏超君  
【摘要】: 研究背景:有机磷对神经细胞的损伤是该领域当今研究的重点。视网膜组织是中枢神经的外延部分,有机磷化合物中毒引起视网膜损伤的病例在临床上时有发生,但其损伤机制的研究国内外尚未见报道。本课题拟在动物模型上进一步采用细胞生物学和分子生物学方法,动态观察有机磷化合物对视网膜细胞的影响,同时利用视网膜原代细胞培养体系观察其直接细胞毒性并从过量乙酰胆碱引发谷氨酸兴奋毒性,促使细胞内钙超载,进而破坏细胞的角度,探讨损伤的发生机制。 目的:应用病理生理学理论,从临床实际出发,通过复制动物模型,观察有机磷化合物对视网膜的损伤作用,并结合相关理论,从有机磷诱导谷氨酸及其受体NMDA的兴奋毒性,导致视网膜细胞内钙超载,最终引起细胞损伤的角度,探讨有机磷化合物损伤视网膜神经细胞的作用机制。为保护生活和职业人群的健康提供科学依据,为保护环境、更安全有效的使用农药提供科学依据,为临床中毒病人在救治过程中尽早预防视觉损伤提供科学依据。 实验分为两部分。 第一部分:有机磷化合物对视网膜神经细胞损伤作用的实验观察 1、用农药毒死蜱复制小鼠有机磷中毒模型。分别于染毒后2h、12h、24h及36h处死动物,剥取视网膜。制作HE染色、尼氏体染色及透射电镜病理切片。在光镜下观察有机磷化合物对视网膜神经细胞的组织学损伤。 2、用常用的有机磷农药敌敌畏、乐果、敌百虫复制家兔有机磷中毒模型。剥取视网膜,制备成单细胞悬液,建立原代视网膜神经细胞培养体系。以台盼蓝染色排除法计数细胞死亡率来观察有机磷化合物对视网膜神经细胞生存状态的影响;以MTT比色分析法测定有机磷化合物对视网膜神经细胞活性的影响;以乳酸脱氢酶测定法观察有机磷化合物对视网膜神经细胞乳酸脱氢酶释放量的影响。 第二部分:有机磷化合物对视网膜神经细胞损伤作用的机制探讨 1、用农药毒死蜱复制小鼠有机磷中毒模型(剂量、方法同第一部分)。剥取正常对照组和毒死蜱中毒36h动物视网膜,采用Fluo-3/Am荧光染料标记法,将视网膜制成铺片,在激光共聚焦扫描显微镜下对比染毒动物视网膜组织与对照组间荧光强度的差异。比较有机磷化合物中毒后36h组动物视网膜组织细胞内Ca~(2+)水平与对照组间的差异。 2、用常用的有机磷农药敌敌畏、乐果、敌百虫复制家兔有机磷中毒模型(剂量、方法同第一部分)。提取视网膜组织的总RNA,以总RNA为模板,用RT—PCR方法来分析NMDA受体NR1亚基的mRNA在染毒组视网膜组织以正常对照组视网膜组织中的表达情况。 结果: 1、有机磷化合物对视网膜神经细胞的组织学损伤:HE染色石蜡切片中,各时间段实验组动物视网膜组织与对照组相比无明显差异,视网膜各层结构清晰,细胞排列有序,实验组无明显核固缩,视杆视锥层未见空泡及其它明显异常变化。硫堇染色切片中,实验组细胞内尼氏体数量略有减少;在24h组和36h组个别神经节细胞层的细胞胞质内有空泡样结构,余未见明显变化。电镜病理切片观察到染毒组视细胞空泡样变,其外节膜断裂,膜盘排列紊乱,出现较多大小不一的脱落膜盘碎片。内节水肿呈不规则形,空泡增多,线粒体轻度水肿。视细胞轴突肿胀、浅染,微管边移,呈束状分布。内核层双极细胞中内质网肿胀扩张,MuLler细胞出现空泡;在双极细胞周围的视细胞轴突出现较严重水肿。随着药物作用时间的延长,视网膜细胞损伤逐渐加重。2、台盼蓝染色排除法计数细胞死亡率的结果显示:有机磷染毒组神经细胞死亡率均有不同程度升高,与对照组相比p<0.01;MTT比色分析法测定结果显示:有机磷染毒组神经细胞活力均有不同程度降低,与对照组相比p<0.05;LDH释放量试验结果显示有机磷染毒组LDH释放量均有不同程度升高,与对照组相比p<0.01。3、荧光染料标记法测定结果显示:对照组小鼠视网膜经荧光染料Flu o-3/Am负载45min后,在激光共聚焦显微镜下细胞内平均荧光强度仅为46.03;而当农药毒死蜱作用机体36h后,视网膜细胞胞浆内荧光强度明显升高,达98.97,与正常对照组相比P<0.01。Ca~(2+)进入视网膜视细胞内,使细胞在激光共聚焦显微镜下清晰可见。4、RT-PCR的实验结果表明:76.67%(23/30)的染毒视网膜组织中,均有NR1亚基mRNA的表达,而相应的正常视网膜组织0%(0/10)NR1亚基的mRNA表达缺失,二者相比差异有显著意义(p<0.01)。经RT-PCR扩增后NR1亚基基因转录片段大小约为288bp,内参照GAPDH片段大小约为470bp,均与理论值相符。与对照组相比,各染毒组均有NR1亚基的表达。统计学分析得知p<0.01。其中,乐果染毒组12h、36h、48h时点的表达差异显示:在染毒后12h、36h后无NR1亚基mRNA的表达,而在48h后则表现为NR1亚基mRNA的表达。 结论: 1.有机磷化合物可造成视网膜神经细胞的形态学损伤,主要影响视锥细胞和视杆细胞,且随着药物作用时间的延长,视网膜细胞损伤逐渐加重。 2.有机磷化合物可影响视网膜神经细胞的生存状态和细胞活性。 3.有机磷化合物对视网膜神经细胞的损伤机理可能与其引发了谷氨酸的兴奋性神经毒性,后者通过NMDA受体造成细胞内钙超载有关。


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