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《兰州大学》 2007年
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藏药抗菌抗病毒作用及机制研究

张春江  
【摘要】: 目的:对甘肃甘南采集的清热解毒类藏药异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜、乌奴龙胆、五脉绿绒蒿、铁棒锤、蒺藜、兔耳草提取物进行了抑菌活性试验;对异叶青兰,甘青乌头,獐芽菜提取物进行了的体内外抗HSV-2的作用研究,并探讨了这些提取物的抗病毒作用机制。最终希望通过上述基础研究获得抗菌抗病毒活性强的藏药。 方法: 1.藏药体外抗菌活性研究:采用琼脂扩散法和微量稀释法,以抑菌圈和最小抑菌浓度为评价指标对八种藏药的水提取物和醇提取物以及异叶青兰挥发油和甘青乌头生物碱进行了体外抑菌活性的初步研究。 2.挥发油成分分析:以GS-MS联用技术分析异叶青兰挥发油化学成分及相对含量。 3.藏药体外抗病毒活性研究:MTT法测定藏药对Vero细胞的毒性,以阿昔洛韦为阳性对照药物,采用细胞病变法、蚀斑法和透射电镜观察考察了异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜体外抗病毒活性。 4.藏药体内抗病毒作用:用HSV-2分别建立小鼠脑炎模型与小鼠生殖器感染模型,以阿昔洛韦作为阳性对照药物,对异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜体内抗单纯疱疹病毒的抗病毒活性进行评价。 5.藏药抗HSV—2的作用机制:采用定量荧光PCR法、扫描电镜观察和蚀斑法考察了异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜体外抗病毒作用机制。 结果: 1.藏药体外抗菌活性研究: a.藏药水提取物和醇提取物对所选菌种都具有一定的抑制作用,形成抑菌圈直径范围为8~22cm,MIC范围为1.56-50.00mg/ml。其中异叶青兰和甘青乌头抑菌活性最强,五脉绿绒蒿基本没有抑菌作用。 b.异叶青兰精油能抑制细菌和酵母样真菌的生长,抑菌圈和最小抑菌浓度MIC范围分别为18-25mm,和0.039-0.156mg/ml。 c.甘青乌头脂溶性生物碱的最小抑菌浓度MIC除对白色念球菌为0.313mg/ml,对其他菌均为1.25mg/ml,水溶性生物碱的最小抑菌浓度MIC除对粪肠球菌为0.625mg/ml,对其他菌均为5.0mg/ml。 2.异叶青兰精油化学成分46.17%属单萜类,28.82%属倍半萜类。从精油中共鉴定出83种主要成分,总含量占全油的89.83%。 3.藏药体外抗病毒活性研究:异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜、阿昔洛韦对Vero细胞的半数中毒浓度(CC_(50))分别为8.43mg/mL,5.54mg/ml,3.23mg/ml,11.02mg/ml。细胞病变法测得异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜、阿昔洛韦抑制HSV-2的EC_(50)分别为1.13mg/ml,0.53mg/ml,1.51mg/ml,1.64mg/ml。蚀斑法测得异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜和阿昔洛韦的EC_(50)分别为0.99mg/ml,1.43mg/ml,3.60mg/ml,0.29mg/ml。治疗指数TI则分别为8.91,6.36,1.05,37.4。用透射电镜观察Vero细胞的超微结构和病毒,发现给药后病毒被明显抑制。 4.藏药体内抗病毒作用:异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜腹腔注射的LD_(50)值分别为15.00,0.85,19.13g/kg。在小鼠脑炎模型中,甘青乌头只延长了小鼠的平均存活时间,对小鼠的死亡未显示出明显的保护率。异叶青兰在剂量为0.5,1.00g/kg治疗时,对小鼠的保护率分别为20%,10%,獐芽菜在剂量为1.00,2.00g/kg治疗时,对小鼠的保护率分别为40%,20%。 5.藏药抗HSV—2的作用机制: a不同给药方式下蚀斑减少试验结果表明:异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜均能直接灭活HSV-2,能够显著抑制HSV-2的感染性;异叶青兰可显著抑制HSV-2对Vero细胞的吸附侵入作用,獐芽菜对病毒的吸附抑制作用弱,而甘青乌头没有抑制作用;异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜均能抑制HSV-2大分子的增值。 b扫描电镜观察异叶青兰抑制HSV-2对Vero细胞吸附的情况,进一步证实异叶青兰可显著抑制HSV-2对Vero细胞吸附。c荧光定量PCR结果表明异叶青兰、甘青乌头和獐芽菜抑制HSV-2 DNA合成的抑制倍数分别达10~6、10~2、10~3。 结论: 1.抑菌测定结果表明:八种藏药水提取物,抑菌活性异叶青兰>甘青乌头>獐芽菜>兔耳草>铁棒锤>蒺藜>乌奴龙胆>五脉绿绒蒿;而对于醇提取物,异叶青兰>甘青乌头>铁棒锤>兔耳草>蒺藜>獐芽菜>乌奴龙胆>五脉绿绒蒿。甘青乌头脂溶性生物碱抑菌作用强于水溶性生物碱。异叶青兰挥发油具有很强的抑菌活性,而且其抑菌活性与高含量的单萜和倍半萜有关。 2.异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜具有较强的抗HSV-2的活性,CPE法和蚀斑法测定结果一致。蚀斑法更为准确敏感。 3.异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜对HSV-2引起的小鼠脑炎表现出不同程度的疗效,存活率提高,平均存活时间(MTD)延长。 4.异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜的抗病毒作用是通过抑制病毒复制循环的各个环节起作用的。 5.异叶青兰、甘青乌头、獐芽菜抗病毒活性的发现为其在藏医药临床中治疗肝炎和其他病毒性疾病提供了理论依据。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R29

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