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《兰州大学》 2008年
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无芒隐子草(Cleistogenes songorica)种质抗旱评价、cDNA文库构建及相关基因克隆与鉴定

张吉宇  
【摘要】: 野生植物携带有潜在的特异基因和变异基因,通过功能基因组的研究和基因挖掘,可揭示此类植物适应环境胁迫的特异机制,为农作物和草类植物的基因改良奠定基础。无芒隐子草(Cleistogenes songorica)为旱生性多年生草类,其极端抗旱性及作为沙漠草原恢复重建种的潜在价值已逐渐得到认可。本研究从收集我国极抗旱野生无芒隐子草种质资源、分析种质抗旱特性基础上,构建其干旱胁迫诱导cDNA文库;通过高通量测序技术平台获得大量cDNA序列;通过高性能生物信息学平台挖掘无芒隐子草抗旱功能基因组信息,进行抗旱相关基因的表达产物分析、转基因模式植物(拟南芥)的功能验证,确定目标基因的功能,为这些基因在草类作物遗传改良中的利用奠定基础。主要结论如下。 收集到我国16份野生无芒隐子草种质资源,采用RAPD标记分析了无芒隐子草种群遗传多样性。用筛选得到的7个随机引物,共扩增出52条DNA片段,其中23条为多态性片段。分子变异分析(AMOVA)结果显示,种群间的变异占总变异的53.19%,种群内不同个体间的变异占总变异的46.81%,种群间的变异存在着显著性差异(P<0.001)。聚类分析将无芒隐子草16个种群大致划分为3个聚类组:第一个聚类组包括10个种群,即:pop1~pop5、pop7、pop13~pop16;第2个聚类组包括pop6、pop8、pop11和pop12;第3个聚类组包括pop9和pop10。 以无芒隐子草遗传差异较大的三个种群CS01,CS09和CS15为材料,通过观察其幼苗体内水分、光合作用参数、叶绿素荧光参数和光合色素等特征,研究其在持续干旱及复水期间忍耐极端干旱的保护机制。证实这三个种群响应干旱胁迫能力存在差异。干旱胁迫过程中,无芒隐子草仍保持相对较高的叶片相对含水量(75%)和叶水势(-3.2 MPa),属于高水势耐旱型植物;光合器官和光合色素含量在干旱胁迫下受到严重影响;而光化学器官的功能影响不大,除PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm略有下降外,其它光化学参数都变化不大。无芒隐子草在持续缺水的环境下,光合速率持续下降,而胞间CO_2浓度变化却不明显,两者变化方向不一致,故初步判断无芒隐子草净光合速率下降归因于叶肉细胞同化能力的降低。 采用SMART技术,构建了无芒隐子草的轻度干旱胁迫根和叶、极度干旱胁迫根和叶共4个cDNA文库,文库Cs01L、Cs02R、Cs03L和Cs04R的重组率分别为78.6%、100%、78.6%和71.4%,插入片段大小在0.2~2.8kb之间。采用5'端随机测序的策略对无芒隐子草不同材料来源的全长cDNA文库进行了测序,共获得5664条序列。去除载体和污染序列,并将50bp以下序列剔除后共计获得3579条高质量序列,总序列长度达到2,191,166bp,平均每个EST长度为613bp。把获得的高质量EST使用phrap进行组装和去冗余后获得1499个重叠群,包括805个独立非冗余序列和694个多成员非冗余序列。基因功能注释(GO)采用与UniProt蛋白质数据库的匹配,60%(899条)无芒隐子草序列得到GO功能注释术语。这些GO术语中包含分子功能、生物过程、细胞组分三个层次,分别占22%、46%和32%。功能注释显示胁迫响应基因63个,其中与抗旱密切相关的基因25个。使用国际上通用的SSR引物设计软件,对1499个无芒隐子草EST(长度共计1.03Mb)进行了SSR分子标记的鉴定,共找到161个SSR特异分子标记。 采用RACE法等相关技术进一步克隆无芒隐子草22个抗旱相关基因全长序列,已经获得全长序列10个。geNorm程序获得无芒隐子草7个内参基因的表达稳定度由高到低依次为:CsEIF5_2>CsEIF5_1>CsGAPDH>CsActin-11>CsUBQ>CsTUA2>CsHistone,以表达相对最稳定的3个内参基因GAPDH、CsEIF5_1、CsEIF5_2获得定量PCR实验中相对定量或绝对定量数据的所有标准化因子,以标准化因子对全部数据进行标准化。通过RT—PCR、qPCR相对定量来鉴定无隐子芒草22个抗旱相关基因的表达,发现有8个基因的表达是由干旱胁迫诱导的,并且受干旱胁迫的差异调控较显著,在胁迫过的根和叶中的表达都较对照增加3倍以上;qPCR绝对定量进一步研究7个基因在不同组织、不同胁迫处理(干旱胁迫0天、4天、6天、8天、10天、以及恢复浇水后1天和4天共7个关键时间点)的表达情况,揭示了这些基因在适应干旱环境过程中的表达调控机制。 CsALDH基因在干旱胁迫下根系中相对表达量是对照的17倍。相对定量和绝对定量结果显示CsLEA2基因只在胁迫诱导下才表达,此基因在胁迫4天后的根中低水平表达,胁迫6天后根和叶中的表达量逐渐增大,干旱胁迫最大的第8天和第10天表达量达到了最大值;无芒隐子草恢复浇水后,基因表达量显著降低,直至浇水后第4天植物恢复正常生长时此基因表达消失。 应用Gateway克隆技术,将CsALDH和CsLEA2基因分别与强组成型启动子CaMV 35S和胁迫诱导型启动子rd29A融合,构建了这两个基因的两种植物表达载体,并获得了拟南芥转基因植株。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S54

【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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9 李培英;新疆草坪用野生偃麦草种质资源评价[D];新疆农业大学;2010年
10 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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【相似文献】
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1 鱼小军;无芒隐子草(Cleistengenes songorica)和条叶车前(Plantago Lessingii)种子的萌发生态学研究[D];甘肃农业大学;2004年
2 魏学;无芒隐子草种子产量与植株密度的关系及坪用特性的研究[D];兰州大学;2010年
3 郭颖;黄土高原四种乡土禾草耗水规律和抗旱特性的研究[D];西北农林科技大学;2010年
4 安宇轩;人工埋藏条件下四种荒漠植物的土壤种子库寿命[D];兰州大学;2007年
5 曲涛;无芒隐子草(Cleistogenes songorica)的抗旱性研究[D];兰州大学;2008年
6 黄文达;三种荒漠植物种子萌发的水热响应[D];兰州大学;2007年
7 邰建辉;无芒隐子草(Cleistogenes songorica)建植与种子生产技术研究[D];兰州大学;2008年
8 武艳培;围栏封育对无芒隐子草(Cleistogenes Songorica)再生和储藏性物质的影响[D];兰州大学;2006年
9 孔令芳;无芒隐子草CsLEA基因克隆及其转化拟南芥的研究[D];兰州大学;2013年
10 余进德;霸王(Zygophyllum xanthoxylum)果翅对种子萌发和土壤种子寿命的影响[D];兰州大学;2009年
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