Mre11蛋白相互作用蛋白的筛选及验证

【摘要】： 生物体基因组DNA时常会受到一系列内源或外源DNA损伤试剂的作用而出现DNA断裂。如果DNA双链断裂不能得到及时有效地修复,会导致基因组不稳定性,如染色体缺失,多拷贝染色体等,引起多种人类疾病。在长期的进化过程中,生物有机体形成了一系列DNA损伤修复机制,以应对损伤的DNA。MRN复合物是参与DNA损伤修复的一个关键分子,由Mre11、NBS1和RAD50蛋白组成。研究发现MRN复合物在DNA双链损伤修复、同源重组、非同源末端连接、端粒结构维持、细胞周期检验点激活、DNA复制顺利进行,以及维持基因组的稳定性等方面都发挥着重要的作用,因此对于MRN复合物功能以及其发挥功能的机制的研究就显得至关重要。 本文以Mre11蛋白N端335个氨基酸残基作为诱饵蛋白(Mre11N335),通过酵母双杂交系统,从黑腹果蝇21小时胚胎cDNA文库中筛选与Mre11蛋白相互作用的分子,从而对其发挥功能的机制进行深入研究。以CG1945酵母菌作为宿主菌,通过SD-T-L-H-3AT营养缺陷培养基进行初筛,初筛得到的阳性克隆通过检测p半乳糖苷酶活性进一步筛选,将筛选到的阳性克隆连续涂三次SD-T-L-H-3AT营养缺陷培养板,丢失酵母菌中没有与Mre11N335蛋白发生相互作用的文库质粒。提取酵母菌中的质粒,用通用引物PCR扩增文库插入片段,HaeⅢ酶切PCR产物,根据PCR产物和酶切产物片段大小对克隆进行分组归类,去除重复。将分类后得到的质粒分别转化大肠杆菌,提取质粒,再次进行PCR扩增,HaeⅢ酶切,进一步进行分组归类。将分类后得到的质粒进行测序,测序结果与果蝇基因的cDNA序列进行比对,将与果蝇基因cDNA序列读码框一致的克隆挑选出来进行体内和体外再验证。体内通过共转AH109酵母菌、AH109酵母菌和Y187酵母菌杂交以及移码突变三个实验来验证。通过体内再验证筛选到五个与Mre11N335蛋白相互作用的基因,分别为CG4035 (eIF-4E), CG1216 (mri), CG4916 (me31B), CG5468 (TweedleM)和CG3140(Adk2)。体外通过免疫共沉淀实验验证这五个基因与Mre11N335蛋白之间的相互作用。CG1216(mri),CG4916(me31B)和CG3140(Adk2)与Mre11N335之间相互作用已经得到证实。