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《兰州大学》 2010年
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拟南芥Athspr突变体的耐热性分析及Athspr基因的原核表达

王云珑  
【摘要】: 本课题组通过启动子诱捕技术获得一个多效突变体,T-DNA的插入造成的基因功能改变使拟南芥植株具有生长发育迟缓,叶片卷曲,植株矮化,抗逆性降低等特征。通过对相关基因的克隆和生物信息学分析发现,该基因是一个全新的,与热激蛋白相关的基因,并命名为Athspr (heat shock protein-related in Arabidopsis thaliana)。本研究以拟南芥Athspr突变体作为材料,对野生型和突变体Athspr的耐热性进行了比较,利用原核表达技术和Ni柱亲和层析技术表达纯化出具有序列特异性的融合蛋白。主要研究成果如下: 1.分析比较了不同的热激胁迫下突变体和野生型的表型差异。在短期热激胁迫中植株未表现出稳定的表型差异。当降低预热激时间(90min→10min)时,突变体表现出更高的致死率;长期的轻微热激胁迫(30℃)后,拟南芥植株具有不同的表型变化,在MS培养基中,上述条件对植株具有致死性,而在长期土培热激胁迫中,植株有稳定表型差异,突变体表现出叶片卷曲严重,营养生长阶段延长,植株不能进入生殖生长等表型。同时对种子进行了热激胁迫,与野生型相比突变体萌发率降低; 2.通过SDS-PAGE凝胶电泳分离ATHSPR蛋白并初步分析热激条件下ATHSPR蛋白在拟南芥植株中的表达情况。比较了不同蛋白提取法提取ATHSPR蛋白的优劣,最终证明硫酸铵分步沉淀法能较好的提取ATHSPR蛋白。在热激后,拟南芥植株中ATHSPR蛋白均有表达,突变体中蛋白表达量降低; 3.通过生物信息学分析,选择位于Athspr基因第三个外显子的957个特异性碱基作为外源基因,利用原核表达,在Trans Rosetta(DE3)中表达出了具有序列特异性的融合ATHSPR蛋白,并通过Ni Sepharose6 Fast Flow凝胶纯化得到了纯度较高的蛋白,为研究蛋白的表达模式和功能奠定了良好的基础。 以上结果表明,T-DNA插入引起的插入位点基因功能的改变,导致了突变体热耐受性的降低。说明Athspr基因可能是调节拟南芥正常生长发育信号通路中极为重要的一员,同时对于拟南芥的热耐受能力的发挥也具有重要的作用。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q943

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【参考文献】
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