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《兰州大学》 2010年
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拟南芥线粒体中交替型NAD(P)H脱氢酶活性复合体的蛋白质相互作用研究

徐晓丽  
【摘要】: 细胞是生命的基本单位,而线粒体是细胞的重要的产能单位,它通过氧化磷酸化合成ATP,为细胞生命活动提供能量。植物线粒体中具有多种交替途径所介导的能量耗散系统,主要包括术端交替氧化途径,解偶联途径和交替型NAD(P)H脱氢途径。交替型NAD(P)H脱氢途径由一类交替型NAD(P)H脱氢酶催化,能够催化电子沿电子传递链传递给O2,但是不伴随质子跨膜梯度形成和ATP产生,因其不能被鱼藤酮所抑制,又被称为鱼藤酮非敏感性NAD(P)H脱氢酶。近年来在分离交替型NAD(P)H脱氢酶方面取得了很多进展。对于蛋白质的研究近年来又成为焦点,在蛋白质复合体水平上的研究,不仅可以揭示未知功能蛋白的功能,还可以在探索已知蛋白在不同复合体中的新的功能。本论文以模式植物拟南芥为研究对象,从拟南芥线粒体可溶性部分中分离到一种具有类似于交替型NAD(P)H脱氢酶活性的复合体。通过质谱鉴定和蛋白质复合体研究手段确定了该复合体中蛋白质—蛋白质相互作用。取得了以下研究结果: 1.利用Native-PAGE从拟南芥线粒体可溶性部分中分离得到一个具有交替型NAD(P)H脱氢酶活性的复合体。利用MALDI-TOF质谱鉴定发现,在这个复合体中除了硫辛酰胺脱氢酶LPD2以外,还存在两个主要的亚基,N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶NAGPR和分子伴侣Cpn20,为拟南芥交替型NAD(P)H脱氢酶的研究作出了补充。 2.利用免疫共沉淀技术(co-IP)研究拟南芥NAD(P)H脱氢活性复合体中各亚基之间的相互作用关系。NAGPR抗体免疫共沉淀发现LPD2和Cpn20可以得到共纯化,但是在LPD2抗体免疫共沉淀和Cpn20免疫共沉淀中只分别得到了Cpn20和LPD2,而没有NAGPR被共沉淀。这些结果说明在这个类似交替型NAD(P)H脱氢酶复合体中,LPD2和Cpn20之间有直接相互作用,而LPD2,Cpn20和NAGPR的之间的相互作用还需要进一步验证。 3.在烟草瞬时表达系统中进行串联亲和纯化实验。在烟草瞬时转染系统中,LPD2-TAPa和NAGPR-TAPa表达水平理想,说明重组的真核表达载体中目的基因没有发生任何突变,而且实现了和串联亲和纯化标签的融合表达。但是在烟草瞬时表达系统中经过串联亲和纯化过程得到的LPD2-TAPa和NAGPR-TAPa复合体在western-blot中显示出显著的非特异性条带,这说明烟草瞬时表达系统不适合用来进行外源性蛋白复合体及外源性蛋白质-蛋白质相互作用关系的研究。 4.在拟南芥稳定表达系统中进行串联亲和纯化实验,体内分析LPD2,Cpn20和NAGPR之间的相互作用关系。LPD2-ATPa的转基因拟南芥全蛋白经过IgG Beads纯化,SDS-PAGE分离和western-blot检测,以TPAa-GFP为阴性对照,在LPD2-TAPa复合体中检测到了Cpn20的存在,但是未检测到NAGPR;在NAGPR-ATPa的转基因拟南芥全蛋白经过IgG Beads纯化,SDS-PAGE分离和western-blot检测,在NAGPR-TAPa复合体中未检测到Cpn20的存在,同时通过TAPa-GFP阴性对照的对比,证实LPD2与NAGPR的结合为非特异性结合,两者之间没有特异性相互作用。 以上研究结果表明,在拟南芥线粒体可溶性部分中分离得到的具有交替型NAD(P)H脱氢酶活性的复合体中,Cpn20作为复合体亚基,和亚基LPD2之间存在特异性相互作用,它们结合在一起,存在于一个复合体中。这是首次揭示他们之间的相互作用。我们推测Cpn20可能协助LPD2进入线粒体后正确折叠,此外,他们之间的相互作用很可能与LPD2的独特功能,例如作为交替型NAD(P)H脱氢酶在植物的产热作用,抵抗逆境,减少活性氧生成,调节细胞内氧化还原状态平衡中的重要作用相关,或者保护LPD2在逆境胁迫下的活性不受影响,参与了植物对逆境胁迫的应答。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q946.1

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