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《兰州理工大学》 2012年
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拟南芥abi5基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达

曹如星  
【摘要】:植物在生长过程中,会遇到诸如干旱、低温和高盐等非生物逆境胁迫,此时植物会产生一系列的生理生化反应,感知、传递逆境胁迫信号,对环境刺激作出反应。在逆境胁迫下,植物表达的基因分为两类:(1)功能蛋白和酶类,如LEA,抗冻蛋白,解毒酶等;(2)传递信号和调控基因表达的转录因子,如bZIP,MYC,DREB等,其中转录因子对基因的转录调控起至关重要的作用。植物通过复杂的信号传导过程,将环境变化转变为细胞内部的信息,经过一系列磷酸化级联反应,最终激发转录因子,启动基因的转录和表达来抵御外界的胁迫伤害。ABA作为一种重要的植物激素和生长调节剂,介导了高等植物在营养生长阶段对各种外界环境的响应和适应。拟南芥ABI5是一个响应ABA信号的bZIP类转录因子,能开启一系列抗性相关基因的表达,在信号的传递、相关功能基因的表达调控以及胚胎发育阶段的调控中起着重要的作用,调节植物的生长发育和对非生物胁迫的耐性。 大肠杆菌因为遗传背景清楚,代时短,易控制成为生产重组蛋白的主要工程菌。目前在利用原核系统表达重组蛋白的过程中常常遇到的几个难题是重组蛋白常常以包涵体的形式存在,表达量低和容易降解等。本研究克隆了拟南芥abi5基因,并将其连接于pET-32a载体上,构建融合蛋白表达载体,转化大肠杆菌BL21系列菌株,并对其进行诱导表达及表达条件的优化,主要结果如下: 1.拟南芥abi5基因的分子克隆:根据NCBI数据库中收录的拟南芥abi5基因的cDNA序列及pET-32a载体序列设计上游引物和下游引物,用Pfu DNA聚合酶通过RT-PCR的方法从拟南芥RNA中扩增得到了拟南芥abi5基因。将其与克隆载体pMD-T Vector连接,得到重组质粒,命名为pUC19-ABI5,并进行测序。测序结果表明所克隆的拟南芥abi5基因全长1323bp,总共编码440个氨基酸。 2.拟南芥abi5原核表达载体的体外构建及转化:按照设计在引物上的内切酶位点,用EcoR I酶切割重组质粒pUC19-ABI5,将得到的abi5基因克隆至pET-32a表达载体的多克隆位点,构建正确的原核表达载体pET32a-ABI5,根据对其基因序列的分析,选择经改造的BL21Star(DE3)作为宿主细胞进行转化,获得BL21/pET32a-ABI5原核表达菌株。 3.原核表达鉴定及表达条件的优化:筛选阳性克隆进行原核表达,经SDS-PAGE电泳检测结果表明拟南芥abi5基因已经结合在pET-32a表达载体上,并形成了融合蛋白,该蛋白可在所选原核细胞中良好表达,并主要以可溶性形式存在,分子量约为67kDa。对BL21/pET32a-ABI5诱导表达的IPTG终浓度,温度及诱导时间各条件进行了优化,经SDS-PAGE电泳分析发现各条件下目标融合蛋白均主要以可溶性形式表达。其中在实验所设各IPTG终浓度和各温度条件下蛋白表达量没有明显的差异,随诱导时间的延长至9h,目标融合蛋白含量明显下降。实验得到目的蛋白可溶性表达的最优条件为:IPTG终浓度为0.3mmol/L,30℃下诱导3h。 拟南芥abi5基因的克隆分析和表达为今后进一步研究该转录因子的调控机理奠定了重要的基础。
【学位授予单位】:兰州理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:Q943.2

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【参考文献】
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