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枸杞多糖修复化学性肝损伤活性组分筛选

李梅林  
【摘要】:《本草纲目》记载:枸杞具有养肝、治肝肾阴亏等功效。现代研究表明:枸杞多糖对化学性肝损伤、药物性肝损伤具有显著的修复功能。枸杞子中发挥肝损伤修复作用的主要有效成分是枸杞多糖。但是,由于枸杞多糖分子量分布广,其修复化学性肝损伤的有效多糖组分未见报道,导致其活性物质基础不明确,限制了其在保健食品、特殊医疗用途食品和药物方面的应用。本文以追踪枸杞多糖修复化学性肝损伤的物质基础为研究主线,采用分级醇沉法或分子排阻色潽法对枸杞多糖进行分离和纯化,并结合动物模型实验或化学活性评价方法对分离得到的每个组分进行活性追踪,系统研究了枸杞多糖修复化学性肝损伤的物质基础,为研发以枸杞多糖修复化学性肝损伤的保健食品、特殊医疗用途食品和药物提供参考。主要研究内容及结果如下:1.枸杞多糖修复化学性肝损伤的生物活性研究。建立CCl_4肝损伤模型,以护肝片和水飞蓟宾作为对照,通过大鼠一般毒性表现、肝组织病理学改变、血清中肝功能相关指标(血清蛋白浓度、血清相关酶活力)的研究,探讨LBP对大鼠肝损伤的修复效应。研究表明:100 mg·kg~(-1)、200 mg·kg~(-1)的枸杞多糖组均可逆转CCl_4所致的血清ALB、TP的异常改变,以及ALT、AST和γ-GT活力的显著升高,同时与护肝片和水飞蓟宾组比较,100 mg·kg~(-1)、200 mg·kg~(-1)的枸杞多糖组大鼠血清ALB、GLB和TP分别与两者比较差异均无统计学意义(p0.05),同时高剂量枸杞多糖组大鼠血清ALT、AST、AKP、γ-GT活力和TBIL含量分别与两者比较差异亦均无统计学意义(p0.05),表明在逆转CCl_4致血清蛋白的异常改变及肝功能相关酶活力等方面,高剂量枸杞多糖组与护肝片和水飞蓟宾的疗效相当。研究提示100 mg·kg~(-1)、200 mg·kg~(-1)具有显著的修复化学性肝损伤作用,且与阳性对照900 mg·kg~(-1)的护肝片和30 mg·kg~(-1)的水飞蓟宾效果相当。2.枸杞多糖修复化学性肝损伤活性部位筛选研究。通过分级醇沉得到了LBP1、LBP2、LBP3和LBP4,并通过DPPH自由基清除能力的考察、超氧阴离子自由基清除能力的考察、总抗氧化能力的考察以及羟自由基清除能力的考察,对4个枸杞多糖组分保护化学性肝损伤活性进行了系统评价。研究发现,4个枸杞多糖组分均具有清除DPPH自由基、清除超氧阴离子自由基的能力和清除羟自由基的能力,4个枸杞多糖组分在清除各自由基效果方面,均为LBP2最优,LBP3次之,由此可以推断其保护化学性肝损伤能力也应该是LBP2组分最好。这与4个组分中枸杞多糖含量和糖醛酸含量大小次序相一致,说明枸杞多糖保护化学性肝损伤活性与其多糖含量和糖醛酸含量呈正相关。由4个组分清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的能力考察可知,清除羟基自由基的能力最强,提示枸杞多糖可能是通过清除羟基自由基的途径发挥修复化学性肝损伤或保护肝脏的能力。3.枸杞多糖修复化学性肝损伤的物质基础研究。考虑到枸杞多糖是一类具有糖肽结构的复杂多糖,因此我们对是否脱蛋白进行了研究。将LBP进行HPLC-DAD-ELSD分离分析,在获得的3个峰中,推测1和2号峰为糖肽组分,3号峰为多糖组分,采用HPLC在线对各组分清除DPPH自由基进行了测定,结果发现糖肽组分清除效果最好,因此在接下来的分离纯化中不考虑脱蛋白。将LBP2进行脱色处理,DEAE-52柱层析纯化,在洗脱曲线中,共获得3个主峰,分别对应水洗脱、0.1 mol·L~-11 NaCl洗脱和0.3 mol·L~-11 NaCl洗脱。其中,LBPⅠ为中性多糖,LBPⅡ和LBPⅢ都为酸性多糖且酸性LBPⅡ﹤LBPⅢ,由蛋白洗脱曲线可知,LBPⅠ中几乎不含蛋白,因此纯化后多糖含量达到89.4%,而其他两个组分都是多糖和蛋白的复合物。将LBP和LBPⅠ~LBPⅢ进行清除自由基活性比较筛选,结果LBPⅡ清除效果最好,说明LBPⅡ是LBP的活性组分,这可能与其供氢能力和活性基团(如羟基、氨基)的数量有关。对LBPⅡ进一步进行Sephadex G-100柱层析纯化,洗脱曲线结果显示为1个峰,且该峰为对称峰。LBPⅡ-1经HPLC鉴定为均一多糖,为以后进一步的结构研究提供了依据。


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