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拟南芥SnRK2.6及AFPs对转录因子ABI5作用位点的研究

魏金魁  
【摘要】:ABI5及其亚家族成员是ABA信号转导通路中关键的碱性亮氨酸拉链类转录因子,它们参与并调控了ABA信号转导途径中的许多生理生化过程,如种子的发育与萌发、各种生物及非生物胁迫的应答等。ABI5的稳定性和转录激活活性受多种激酶和磷酸酶的调节。虽然有报道表明,过表达ABI5植株无明显表型,但是ABI5多个位点的模拟磷酸化突变体在不施加外源ABA的情况下可以激活ABI5控制的下游基因的转录表达,因此认为ABI5的磷酸化修饰对ABI5的转录激活活性起重要作用。Sn RK2家族被认为介导了ABI5多个位点的磷酸化,其中研究的较为清楚的是Sn RK2.6。我们通过多序列比对分析发现ABI5上存在多个Sn RK2的潜在磷酸化位点,但是这些潜在磷酸化位点是否均能被Sn RK2.6识别并磷酸化目前还不清楚。AFPs是一类能与ABI5发生相互作用的蛋白分子。有研究表明AFPs可促进ABI5的泛素化降解,并负向调节ABA信号。然而AFPs是如何通过促进ABI5蛋白降解来实现对ABA信号的负向调节的分子机制还不清楚。我们先前的研究表明AFP4/5可介导/激活ABI5的转录激活活性。然而,在AFPs上既没有激酶活性也没有发现相应的磷酸酶的保守结构,那么这类蛋白到底是如何影响ABI5活性的呢?本研究利用酵母双杂交系统对AFPs结合ABI5时的具体的相互作用位点进行了研究,以期通过酵母系统来寻找AFPs结合ABI5时精确的相互作用位点,从而为理解AFPs介导ABI5转录活性或/和稳定性的分子机制提供依据。本研究对ABI5亚家族九个成员进行了多序列比对,在ABI5上确定了6个Sn RK2的潜在磷酸化位点,利用酵母双杂交技术研究了Sn RK2.6以及AFPs与ABI5识别结合关系,结果如下:(1)虽然ABI5上有多个Sn RK2的潜在磷酸化位点,但Sn RK2.6并不能识别所有这些潜在磷酸化位点,Sn RK2.6在结合这些位点时具有一定的选择性;(2)在酵母中Sn RK2.6只能识别结合ABI5上的RQGS一个潜在磷酸化位点,且该位点在ABI5亚家族成员中是高度保守的;(3)通过一系列ABI5的缺失突变体,找到了AFPs结合ABI5的一个较为精确的位点,即FGEMTLEDFLVK;(4)Nam-Hai Chua实验组在2002年报道了AFP1在ABI5上仅结合ABI5 199-221aa区域,而我们的结果中AFP1以及AFP5与Chua的结果保持一致,但不同的是AFP2/3/4除了可以和ABI5 175-221aa发生相互作用在外,还可以和ABI5 1-135aa发生相互作用,即,AFP2/3/4在ABI5上有两个相互作用位点;(5)ABI5 1-135aa以及ABI5 202-213aa点突变体的酵母实验表明,ABI5第47、206位的Thr残基对ABI5 1-135aa和ABI5 202-213aa与AFP4发生相互作用是重要的,T47突变为A或E后,AFP4均不能与ABI5 1-135aa发生相互作用。同样的T206突变为A或E后,AFP1/2/3/4也均不能与ABI5 202-213aa发生相互作用。


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