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《甘肃农业大学》 2010年
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川芎嗪诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞的信号转导机制

刘云云  
【摘要】: 本研究利用中药川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)单体诱导小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs),探讨了川芎嗪体外对小鼠BMSCs分化为神经细胞的影响及信号转导的分子机制。 实验分为3组:川芎嗪诱导组(含2.4 g/L川芎嗪)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol, BME)阳性对照组和阴性对照组(未诱导的BMSCs)。各组进行同步实验,运用RT-PCR技术检测神经干细胞巢蛋白(nestin)基因、未成熟神经元β-微管蛋白III (β-Tubulin III)基因、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)基因和核受体相关因子1(nuclear receptor relatedfactor 1, Nurr1)基因及神经胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)基因的表达,荧光免疫化学和Western blot方法检测nestin和NSE蛋白的表达。 利用EGTA(细胞外Ca~(2+)螯合剂)、Nifedipine(细胞膜L-型Ca~(2+)通道阻断剂)和LY294002(PI3K信号通路阻断剂)分别或同时阻断细胞不同的Ca~(2+)途径,运用PD98059阻断MEK-ERK信号通路、SB203580阻断p38MAPK信号通路、PD98059和LY294002同时阻断MEK-ERK和PI3K信号通路、SB203580和LY294002同时阻断p38MAPK和PI3K信号通路,阻断的同时用川芎嗪诱导BMSCs,运用RT-PCR和Western blot方法检测阻断前后,川芎嗪诱导BMSCs神经定向分化中NSE、Nurr1 mRNA及NSE蛋白的表达变化,探讨细胞不同Ca~(2+)信号、MEK-ERK和p38MAPK信号转导通路对川芎嗪诱导BMSCs的神经定向分化的作用。 结果表明,川芎嗪诱导BMSCs后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞,且诱导时细胞死亡率低于BME阳性对照组。免疫荧光化学和Western blot结果显示,川芎嗪诱导后的细胞nestin和NSE蛋白表达呈阳性,表达丰度显著高于阳性对照组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl,表明川芎嗪能定向诱导小鼠BMSCs分化为神经元样细胞,是较理想的神经诱导剂。与对照组相比,单独或同时阻断细胞外Ca~(2+)、细胞膜L-型Ca~(2+)通道和PI3K信号通路后,对川芎嗪诱导BMSCs的神经分化具有协同促进功能;胞外过量的Ca~(2+),对川芎嗪诱导BMSCs的神经定向分化具有抑制作用;阻断MEK-ERK、p38MAPK信号通路、同时阻断MEK-ERK和PI3K信号通路及p38MAPK和PI3K信号通路时,抑制川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞的定向分化。 因此,川芎嗪通过不同的Ca~(2+)信号途径、MEK-ERK及p38MAPK信号转导通路调节川芎嗪诱导BMSCs向神经细胞的定向分化。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q813

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