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《甘肃农业大学》 2010年
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桃儿七离体培养体系的建立与发状根诱导研究

张丽娟  
【摘要】: 桃儿七( Sinopodophyllum hexandrum(Royle)Ying)是小檗科(Berberidaceae)鬼臼亚科(Podophylloideae)桃儿七属多年生草本植物。其根和根茎中含有的鬼臼毒素,是合成抗癌药物的重要原料来源。随着人们生活水平与质量的不断提高,对抗癌药物的需求也日益增大,对桃儿七资源的需求量也不断增加。由于桃儿七生长缓慢、对生长环境要求高、分布区域狭小,野生资源稀缺,导致市场紧俏。加之近年来大量人工挖掘以及人工栽培困难,使桃儿七资源面临濒危境地,目前已被列入《中国珍稀濒危植物名录》,国家三级保护植物。因此,利用植物细胞工程技术的原理与方法,人工繁殖桃儿七并进行“鬼臼毒素”的工业化生产,具有重要的理论与实践意义,被普遍认为是一条有效保护与利用桃儿七这一濒危稀缺资源,缓解“鬼臼毒素”市场需求的一条重要的新途径。 本实验以桃儿七种胚为材料,通过对无菌苗诱导及培养方法的优化,建立了高效、稳定的种胚培养体系,并以桃儿七种胚和抱窝磷茎为受体,利用发根农杆菌2100转化诱导毛状根研究,以期建立桃儿七毛状根培养体系和筛选高含量“鬼臼毒素”培养系的研究。主要取得如下研究结果: 1.桃儿七种胚离体培养的建立与优化 桃儿七种胚离体培养最佳培养基MS+IAA0.5mg/L+KT0.2mg/L+GA30.3mg/L,诱导率达到98.34%。22℃低温和全天候光照最适于桃儿七无菌苗的诱导,有效降低褐化率。继代培养最佳培养基MS+对苯二酚0.5mg/l +AC0.5 mg/l,抱窝鳞茎增多,根逐渐生长变粗,有效解决了无菌苗细弱,生根难的问题。1-5mg/L对苯二酚与0.5mg/LAC对桃儿七无菌苗生根培养具有明显促进作用。添加适宜浓度的AC明显降低种胚的褐化率,有效提高诱导率;创造的黑暗环境有利于根的诱导和根系的生长。 2.桃儿七发状根的诱导 本实验历时一年,以发根农杆菌R1000与2100为转化菌株,对转化受体、培养条件、转化方法进行多次对比调试,每种处理接种80粒,进行4次重复,最终以种胚为感染受体,预培养1天,用发根农杆菌2100菌液OD600值在0.2-0.4之间侵染15分钟,共培养1天,500mg/Lcef进行脱菌培养,侵染获得毛状根均在此条件下获得。光照有利于桃儿七毛状根的诱导,黑暗条件下转化的外植体均未诱导出毛状根。发根农杆菌2100转化桃儿七获得毛状根无向地性但生长缓慢,无多分枝,并不完全具备毛状根的典型特征,且诱导率极低,无法进行PCR检测,不能确定即为发根农杆菌转化所得毛状根。 3.葡萄发状根的对照诱导与检测 为证实桃儿七发状根诱导的困难和验证所采用的转化方法的可靠性,用发根农杆菌2100对葡萄单芽茎段进行对照诱导实验,在茎段的基部产生了大量的毛状根系,呈黄白色,无向地性、多分枝、生长迅速等特点,具备毛状根的典型特征。经PCR检测,发根农杆菌含有的RiT-DNA的rolC发根基因已整合进入葡萄基因组中,证明本实验所采用的毛状根诱导菌株与转化方法可行。 鉴于桃儿七鬼臼毒素工业化生产的必要性,有必要继续深入发根农杆菌对桃儿七遗传转化的研究。下一步工作可以考虑通过物理化学的方法对转化外植体进行处理,提高其对发根农杆菌的敏感度;同时,对脱菌方法进行进一步摸索,提高除菌效果的同时减少对外植体的毒害。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S567.239

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【参考文献】
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