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《甘肃农业大学》 2010年
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抑制素基因工程疫苗的研究与应用

郭宪  
【摘要】:本文综合应用生物信息学技术、基因克隆技术、蛋白质分析技术、基因免疫技术、酶免疫测定技术、放射免疫测定技术等,以猪抑制素α亚基(1~32)基因及绵羊补体C3d基因作为选择基因,制备串联抑制素基因工程疫苗,用于基因免疫绵羊,研究串联抑制素基因免疫对母羊生殖及生殖内分泌的影响,探讨其作用机制。通过串联抑制素基因疫苗应用研究,探索串联抑制素基因疫苗免疫方案,达到提高绵羊繁殖力、降低生产成本、推广繁育新技术的目的,并为抑制素基因疫苗的成功研制奠定基础。主要内容如下: 1.猪抑制素α亚基抗原表位的预测 综合应用在线软件PredictProtein、DNAStar软件、Antheprot软件和现代生物信息学技术,分析猪抑制素α亚基的二级结构、抗原表位、亲水性、疏水性、Coil区域、易溶性等理化特性,旨在预测其抗原位点和抗原表位。结果表明:猪抑制素α亚基可能的抗原位点分别是N端1~32、105~130氨基酸区段。由于N端有多个Pro,易构成Coil结构,对抗原表位的形成有一定的影响,所以猪抑制素α亚基的抗原表位可能位于1~32。 2.串联抑制素基因疫苗的制备与鉴定 应用基因克隆技术,以猪抑制素α(1~32)基因及绵羊补体C3d基因为选择基因,并引入狗前胰岛素原信号肽基因,制备串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3。通过酶切鉴定,串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3构建正确,并在BHK-21细胞中获得了分泌型表达,为羊抑制素基因工程疫苗的研制奠定了基础。 3.串联抑制素基因疫苗对绵羊生殖激素的影响 根据基因免疫技术,以成功制备的串联抑制素重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3为免疫原,对60只绵羊进行基因免疫试验,应用酶联免疫法(ELISA)检测抗抑制素抗体、放射免疫法(RIA)测定处理后不同时期血清中激素水平。结果表明:重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊后,各实验组P/N值均显著高于对照组(P0.05),且在第3次加强免疫后抗体水平明显上升。首次免疫后,促卵泡素(FSH)平均含量均高于对照组,且在第2次、第3次加强免疫阶段差异显著(P0.05)。第2次免疫后促黄体素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)含量均高于对照组(P0.05),第3次加强免疫后E2、P含量均显著高于对照组(P0.05)。这些结果表明,串联抑制素基因免疫绵羊可促进FSH分泌,进而影响绵羊卵泡发育和诱导绵羊产双羔。 4.串联抑制素基因免疫诱导绵羊孪生的研究 为了研究串联抑制素基因免疫对绵羊孪生的影响,以制备的串联抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3为免疫原,对120只绵羊进行免疫试验。结果表明:0.6 mg pcDNA-DPPISS-DINH和0.8 mg pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊后,双羔率分别为22.2%和30.0%,均与对照组间差异显著(P0.05),并且分子佐剂sC3d能增加绵羊对串联抑制素基因免疫的反应性。串联抑制素重组质粒成功诱导绵羊孪生的研究,为抑制素基因疫苗的研制提供了理论依据和技术支撑。 5.串联抑制素基因免疫的安全性研究 用高于正常实验组5倍、10倍(重组质粒pcDNA-DPPISS-DINH 1.5 mg、3.0 mg;pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3 2.0 mg、4.0 mg)的免疫剂量对8只绵羊进行基因免疫试验,旨在确定串联抑制素基因免疫绵羊的安全性。结果表明:串联抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊后,实验羊的精神、食欲、运动等均无异常,体温、脉搏、呼吸均无明显变化,没有观察到基因免疫的任何毒副作用与不良反应。由此得出结论,串联抑制素基因疫苗pcDNA-DPPISS-DINH和pcDNA-DPPISS-DINH-sC3d3免疫绵羊诱导其孪生是安全、可靠的。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.5

【参考文献】
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