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贯叶连翘的固体发酵工艺及电子束辐照研究

靳振召  
【摘要】:在中药提取过程中,细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时,必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力,贯叶连翘的有效成分被包裹在由纤维素、半纤维素和木质素等构成的细胞壁中,不利于有效成分的提取。基于纤维素酶能促进中草药有效成分提取的研究基础上,本实验采用黑曲霉发酵的方法,通过降解贯叶连翘中的粗纤维含量,从而促进贯叶连翘中金丝桃素和金丝桃苷的提取。 本论文以提高发酵后贯叶连翘中金丝桃素和金丝桃苷的含量为目的,首先采用高效液相色谱建立了金丝桃素和金丝桃苷的含量测定方法,其次,研究黑曲霉发酵贯叶连翘的最佳发酵工艺,最后,采用电子束对贯叶连翘及其发酵物进行辐照研究。本课题的主要研究内容如下: 1.金丝桃素反相高效液相色谱法的建立。优化所得最佳色谱条件为:Agilent HC-C18(5μm,4.6 mm×250 mm),乙腈︰甲醇︰乙酸铵缓冲液(0.30 mol/L,冰醋酸调pH值至4.0)=50︰40︰10,检测波长588 nm,流速1 mL/min,进样量20μL,柱温25℃。金丝桃素保留时间在11.0 min,含量测定标准曲线方程为Y=3×106X-144070(r=0.9999);线性范围,0.0512μg/mL~10.0μg/mL;加样回收率在94.55%-101.07%;其它各项方法学指标如稳定性、精密度、重现性等均符合药典规定,能够满足该药的分析测定。 2.金丝桃苷反相高效液相色谱法的建立。优化所得最佳色谱条件:即依利特Hypersil ODS2(5μm,4.6 mm×250 mm),乙腈︰四氢呋喃︰0.1%磷酸=17︰10︰73,检测波长360 nm,流速1.0 mL/min,进样量20μL,柱温25℃。金丝桃苷保留时间在8.6 min左右,含量测定标准曲线方程为Y=473282X+3×10~6(r=0.9989);线性范围,6.547μg/mL-50.520μg/mL;加样回收率在95.03%-100.32%之间;其它各项方法学指标均符合要求,说明该方法适宜做金丝桃苷的含量测定。 3.黑曲霉发酵贯叶连翘。采用单因素试验设计,考察了固体发酵的温度、初始pH、时间、料液比、葡萄糖含量、接种量和表面活性剂Tween80等7个因素对金丝桃素和金丝桃苷含量的影响。并采用L_(16)(4~5)正交试验,考察温度、初始pH、料液比、接种量和葡萄糖含量等5个因素对黑曲霉发酵贯叶连翘的综合影响,确定了最佳的发酵工艺。最佳的发酵工艺是:称取10 g贯叶连翘粉,按1:2的比例加入20 mL Mandels液(葡萄糖含量为5%,pH为5.5),接种1 mL种子液,发酵96 h,0 h-24 h在30℃下发酵,25 h -96 h在25℃下发酵。结果发现,发酵后粗纤维含量降低16.74%,金丝桃素含量增加了26.53%,金丝桃苷含量增加了22.46%。通过对比发酵与未发酵贯叶连翘的提取物中金丝桃素和金丝桃苷的总量发现,贯叶连翘经过发酵后,其提取物中金丝桃素总量增加了22.79 mg(24.02%),金丝桃苷总量增加了76.68 mg(19.56%)。 4.发酵产物的电子束辐照研究。首先考察了不同辐照剂量对贯叶连翘发酵物中微生物数量的影响,并依据微生物存活对数与辐照剂量的线性关系,确定D_(10)值。其次研究了6.0 kGy剂量辐照下贯叶连翘发酵物中微生物的生长情况,结果表明,发酵物经过6.0 kGy的剂量辐照后,可以保存60 d,其卫生指标仍达到国家药典中规定的含发酵成分药材的微生物限度标准。最后,通过对贯叶连翘提取物2和4的比较表明,经过辐照能显著提高贯叶连翘提取物中金丝桃素总量,金丝桃素总量增加了11.08 mg(9.42%);通过对贯叶连翘提取物1和4的比较表明,贯叶连翘经过黑曲霉发酵和电子束辐照共同作用,能最大限度的提高提取物中的金丝桃素和金丝桃苷含量,金丝桃素总量提高了33.87 mg(35.71%),金丝桃苷总量提高了82.96 mg(21.15%)。 本论文为提高贯叶连翘中有效成分的提取率,首次进行了贯叶连翘的黑曲霉发酵和电子束辐照研究,优化了固体发酵的工艺参数,并找到了合适的辐照剂量,使贯叶连翘中有效成分金丝桃素和金丝桃苷含量明显增高。这些研究的开展将为中兽药的开发利用提供新的方法。


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