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种传西瓜细菌性果斑病菌快速分子检测方法研究

王婧  
【摘要】:由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)引起的西瓜细菌性果斑病是西瓜等葫芦科作物的典型种传病害,也是重要的检疫对象之一。由于化学药剂处理无法完全清除该病原,因此,种子检疫成为控制该病的重要手段。由于西瓜种子较大,带菌率偏低,传统方法常导致微量病原的漏检。因此,迫切需要开发简单易行、快速灵敏的检测方法。本文研究了几种分子生物学方法对种传西瓜细菌性果斑病菌的检测,主要结果如下: 1.采用直接高温裂解释放DNA,进行PCR扩增,无需专门DNA提取,以检测灵敏度、稳定性、时间及成本为指标对Bio-PCR、MF-PCR、IMS-PCR、IC-PCR、Direct-PCR、DAS-ELISA6种方法进行了综合评价的结果表明:IC-PCR和IMS-PCR检测灵敏度和重复性最高,最低检测限分别为4.7×10~2cfu/mL和4.7×10~2~4.7×10~3cfu/mL,0.1%带菌率的种子阳性检出率66.7%,检测时间比Direct-PCR的4h和MF-PCR的5h要长,但仍可控制在12h内。 2.建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的Nested-PCR检测方法,优化50μL反应体系:7.5μL10×PCR buffer(25mM MgCl2)、4μLdNTP(D4030RA,2.5mM)、引物(5μM/L)各3μL,0.25μLTaq DNA酶(DR001B,5U/μL)。该体系下以直接高温裂解释放DNA进行PCR扩增的结果清晰。 3.采用Nested-PCR方法,以50μL优化体系对Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液和不同带菌率的种子洗液进行检测,结果表明:最低检测限2.4×10~1cfu/mL,0.1%带菌率的种子阳性检出率100%。 4.建立了可视化抗体芯片检测方法。以硝酸纤维素膜为基片,以西瓜细菌性果斑病菌为模式病原,对其特异性捕获抗体以阵列模式点样排布固定制成抗体阵列,并对点样浓度、封闭条件、杂交反应条件、显色时间等主要参数进行优化。 5.采用可视化抗体芯片检测技术对Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液和不同带菌率的种子洗液进行检测的结果表明:最低检测限2.4×10~4~2.4×10~5cfu/mL,以1/25的捕获抗体用量,以及1/8的检测时间便可达到ELISA的同等检测能力,且成本低,操作简便。


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