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《甘肃农业大学》 2015年
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鸡朊样蛋白Shadoo、Doppel基因的序列分析及PrP基因的毕赤酵母表达

张天亮  
【摘要】:【目的】克隆并分析鸡Pr P样蛋白(Shadoo、Doppel)基因(SPRN、PRND),探究它们与Pr PC的关系,为禽源Shadoo(Sho)、Doppel(Dpl)结构与功能、与Pr PC互作关系机制的研究提供理论依据与分子基础;同时,构建鸡Pr P基因(PRNP)的真核表达载体p PIC9K-Ch Pr P(25~248),通过毕赤酵母表达系统获得的重组鸡朊蛋白(Ch Pr P),为朊蛋白在不同生理状态下的折叠形态及PrPC向PrPSc转换机制的研究提供材料。【方法】根据Gen Bank收录的鸡SPRN(Ch SPRN)序列设计特异性引物,以鸡脑组织基因组DNA为模板,扩增鸡脑组织中SPRN基因完整ORF;通过比对多物种Dpl蛋白的氨基酸序列找到PRND基因的保守区,设计简并引物并依据鸡的密码子偏好性对引物进行优化,以逐步降低其简并性。用此特异性引物以聚合酶链式反应(PCR)扩增出鸡PRND(Ch PRND)基因;将两者分别克隆到p MD-18-T载体,测序鉴定后应用生物信息学方法与软件进行分析并将序列上传Gen Bank数据库。结合Sho、Dpl与Pr PC相关研究,分别分析其相互关系。根据毕赤酵母的密码子偏好性、G+C含量等特点对目的基因Pr P(25~248)进行密码子优化与基因合成。同时,扩增优化前的目的序列。之后,将两者均连于p PIC9K、转至GS115。经PCR扩增和接种MM、MD平板鉴定后,诱导表达、SDS-PAGE检测。【结果】Ch SPRN长354bp,在第23位与第56位发生G→A突变,均为C→Y突变。分析氨基酸序列并利用同源法构建Ch Sho与Ch Pr P的三级结构,结果显示它们N-端同源性为44.25%,C-端结构相似性为23.33%;多物种Dpl氨基酸序列比对发现,第11~150位(139个氨基酸残基)为Dpl氨基酸序列保守区,以此区域设计引物并进行PCR扩增,得到约417bp的目的条带,将其提交Gen Bank,登录号为KP140962。综合分析Pr PC与Dpl相关研究发现,尽管Dpl与Pr PC具有相似的翻译后修饰和空间结构,但两者多表现为拮抗作用,尤其是Pr PC N-端包含八肽重复区的第23~88个残基对于保护Purkinje细胞免受Dpl诱导的神经退化作用至关重要;经鉴定,成功构建了p PIC9K-Pr P(25~248),并在GS115中获得表达;与未经优化前相比,优化后蛋白具有更高的表达量。【结论】(1)Ch Sho与Ch Pr P在序列与结构中都表现出惊人相似性;(2)首次成功克隆获得鸡PRND基因;(3)利用毕赤酵母真核表达系统成功获得重组鸡朊蛋白,且通过密码子优化得到了比优化前较高的蛋白表达量。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.23;Q78

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 高永军;高晨;陈建明;石琦;郭燕;张宝云;董小平;;人朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化及抗体的制备[J];中国病原生物学杂志;2007年03期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 姚海兰,聂凯,韩俊,肖新莉,陈岚,王小凡,周伟,姜慧英,蔡昌学,董小平;一种新型原核表达载体的构建及应用[J];华中科技大学学报(医学版);2004年05期
【相似文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 张天亮;鸡朊样蛋白Shadoo、Doppel基因的序列分析及PrP基因的毕赤酵母表达[D];甘肃农业大学;2015年
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