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《甘肃农业大学》 2017年
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马铃薯光诱导糖苷生物碱代谢相关miRNAs的鉴定与功能分析

乔岩  
【摘要】:糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloids,SGAs)是茄科植物(Solonum)和某些百合科(Liliaceae)植物中存在的一类次生代谢物,具有抑制病原微生物侵袭、拒避昆虫采食、抗渗透胁迫和化感效应,但马铃薯(Solonum tuberosum L.)块茎中SGAs含量较多时会影响到食用风味和安全性。因此,培育叶片中SGAs含量高而块茎中含量低的品种(系),对于提高马铃薯的抗逆性并满足食用安全性至关重要。马铃薯SGAs的合成是一个复杂的代谢网络体系,相关酶基因呈共表达趋势,且在染色体上成簇分布,但目前对SGAs合成代谢相关miRNA的调控机制尚不清楚。鉴于红光诱导可以显著地提高SGAs合成积累,本研究以红光诱导/暗处理的马铃薯普通栽培种和野生种二倍体种恰柯薯(Solanum chacoense)为材料,进行小RNA、转录组和降解组测序,分析光诱导下的miRNAs及作用靶标,确定涉及SGAs代谢途径的miRNAs,并通过绿色组织过表达重要miRNA,以鉴定其对SGAs的调控作用。主要研究结果如下:1.在马铃薯普通栽培种(S.tuberosum,2n=4X=48)中,共鉴定出277个已知miRNAs和120个新miRNAs;红光诱导下,分别有31个(叶片)和48个(块茎)miRNAs发生差异化的表达。转录组分析表明,在叶片和块茎中,分别有1353个和1841个DEGs上调,有1595个和897个DEGs下调。q RT-PCR检测表明,小RNA高通量测序和转录组测序数据良好。2.在块茎中光敏感型基因GO功能富集表明,生物过程涉及到次生代谢、杂环化合物的生物合成、四吡咯的代谢、叶绿素II和倍半萜类物质的合成。Mapman功能分析表明,在叶片和块茎中涉及主要碳水化合物代谢的基因表达量显著下降,而涉及次生代谢的基因表达量明显上调,特别是催化SGAs合成代谢(甲瓦龙酸/类异戊二烯代谢途径)第一阶段的相关酶基因明显增多和上调。叶片和块茎中与生物碱代谢相关的ORCA和b HLH转录因子明显上调;两类次生代谢相关的酶家族(CYP450酶、UDP-糖基转移酶)成员在叶片和块茎中差异化表达明显。3.miRNAs-m RNAs整合分析表明,在叶片和块茎中分别有41对和73对负向调节的miRNA/m RNA受红光调节。其中,叶片中靶基因生物功能富集涉及葡聚糖的分解代谢、茉莉酸介导信号转导和UMP补救合成;块茎靶基因则涉及碳水化合物的代谢、NAD(P)H脱氢酶复合物的组装、糖介导的信号转导途径和非编码RNA的加工。整合分析表明,叶片miRNAs可靶向生物碱合成的b ZIP和b HLH转录因子,而上调的miR482b-3p可靶向uk激酶(能增加SGT2底物—配糖基供体UDP-葡萄糖);miR479则靶向糖苷生物碱合成的CYP450酶(CYP71D7)。4.恰柯薯(S.chacoense,2n=2X=24)是一SGAs含量高,能分离出抗虫、抗病和抗逆基因的二倍体野生种。对红光诱导下的块茎sRNA高通量测序,共鉴定出Group 1的187个已知miRNAs和163个p5/p3 miRNAs,Group 2的204个已知miRNAs和220个p5/p3 miRNAs;共有337个新的miRNAs。其中,有24个高度保守miRNA家族,最大的是miR156。k-means聚类结果表明,恰柯薯光诱导下的miRNAs可划分为9个类群(k1-k9),共呈现出持续上调(k2,k3,k4,k5)、持续下调(k1,k8,k9)、早期上调(k6)和早期下调(k7)四种表达模式,表明光可以动态调控特定miRNAs,这类miRNAs则涉及多种生物学功能和代谢过程。5.降解组测序共检测到恰柯薯miRNAs的1319条特有转录本。靶基因GO功能富集表明,在红光诱导下,更多的miRNAs靶基因的GO功能被富集到TD24(红光持续照射24 h)和TD72(红光持续照射72 h)降解组文库;在TD24文库中,miRNAs生物功能主要富集到细胞凋亡、双信号转导系统、防卫反应和染色质重塑;而在TD72文库中,miRNAs则富集到细胞凋亡、钾离子转运、核黄素的生物合成过程和甾类化合物的代谢。6.sRNA与降解组测序联合分析表明,光敏感型miRNAs可操纵与逆境胁迫相关的MYB4转录因子、热休克蛋白(HSPs)及与ROS调节有关的EBF1/EBF2基因表达量,以实现对逆境的交叉适应性。此外,光敏感型miRNAs可参与植物初生及次生代谢调控。其中,miR390和miR8175异构体能靶向调控四吡咯类物质合成的CPO I氧化酶和CHLP还原酶;miR8033异构体能靶向调控黄酮类物质合成的MYB4转录因子。进一步研究发现,光敏感型miRNAs能调控SGAs合成相关基因。其中,athmiR8175/gma-6300异构体能剪切AMPK激酶,进而磷酸化SGAs代谢相关的HMG-Co A还原酶;miR156-SPLs调控元件则能调控倍半萜类物质的生物合成;miR482则靶向与甾醇类物质代谢相关基因3-β羟甾类脱氢酶/异构酶。此外,zma-MIR2275cp5_2ss14TA17AC和PC-3p-11646_92则能靶向与糖苷生物碱代谢相关的Cytochrome P450和CYP72A58基因。7.以p RS300的衍生载体p RSA-4为基础,构建了35S启动子驱动的植物表达载体p CE35s-miR408和多顺反子表达载体p CE35s-dmiR408;并构建了rbc S启动子驱动的植物表达载体p CEr-miR408和多顺反子表达载体p CEr-dmiR408。用农杆菌介导法对陇薯3号、陇薯6号和费乌瑞它进行遗传转化,通过草甘膦筛选得到p CEr-miR408转化再生植株27个,p CEr-dmiR408转化再生植株16个,采用PCR分别鉴定出18株和13株阳性转基因植株。q RT-PCR分析表明,p CEr-miR408和p CEr-dmiR408转化阳性植株的光合组织中miR408的表达量较以野生型对照(陇薯6号)明显提高,而靶基因VS1的表达量明显降低,这表明miR408与VS1基因的表达呈相反趋势,但对于转化阳性植株光合组织中的SGAs含量仍需进行深入的验证和分析。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S532;Q943.2

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