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《甘肃农业大学》 2017年
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马铃薯光诱导糖苷生物碱代谢相关miRNAs的鉴定与功能分析

乔岩  
【摘要】:糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloids,SGAs)是茄科植物(Solonum)和某些百合科(Liliaceae)植物中存在的一类次生代谢物,具有抑制病原微生物侵袭、拒避昆虫采食、抗渗透胁迫和化感效应,但马铃薯(Solonum tuberosum L.)块茎中SGAs含量较多时会影响到食用风味和安全性。因此,培育叶片中SGAs含量高而块茎中含量低的品种(系),对于提高马铃薯的抗逆性并满足食用安全性至关重要。马铃薯SGAs的合成是一个复杂的代谢网络体系,相关酶基因呈共表达趋势,且在染色体上成簇分布,但目前对SGAs合成代谢相关miRNA的调控机制尚不清楚。鉴于红光诱导可以显著地提高SGAs合成积累,本研究以红光诱导/暗处理的马铃薯普通栽培种和野生种二倍体种恰柯薯(Solanum chacoense)为材料,进行小RNA、转录组和降解组测序,分析光诱导下的miRNAs及作用靶标,确定涉及SGAs代谢途径的miRNAs,并通过绿色组织过表达重要miRNA,以鉴定其对SGAs的调控作用。主要研究结果如下:1.在马铃薯普通栽培种(S.tuberosum,2n=4X=48)中,共鉴定出277个已知miRNAs和120个新miRNAs;红光诱导下,分别有31个(叶片)和48个(块茎)miRNAs发生差异化的表达。转录组分析表明,在叶片和块茎中,分别有1353个和1841个DEGs上调,有1595个和897个DEGs下调。q RT-PCR检测表明,小RNA高通量测序和转录组测序数据良好。2.在块茎中光敏感型基因GO功能富集表明,生物过程涉及到次生代谢、杂环化合物的生物合成、四吡咯的代谢、叶绿素II和倍半萜类物质的合成。Mapman功能分析表明,在叶片和块茎中涉及主要碳水化合物代谢的基因表达量显著下降,而涉及次生代谢的基因表达量明显上调,特别是催化SGAs合成代谢(甲瓦龙酸/类异戊二烯代谢途径)第一阶段的相关酶基因明显增多和上调。叶片和块茎中与生物碱代谢相关的ORCA和b HLH转录因子明显上调;两类次生代谢相关的酶家族(CYP450酶、UDP-糖基转移酶)成员在叶片和块茎中差异化表达明显。3.miRNAs-m RNAs整合分析表明,在叶片和块茎中分别有41对和73对负向调节的miRNA/m RNA受红光调节。其中,叶片中靶基因生物功能富集涉及葡聚糖的分解代谢、茉莉酸介导信号转导和UMP补救合成;块茎靶基因则涉及碳水化合物的代谢、NAD(P)H脱氢酶复合物的组装、糖介导的信号转导途径和非编码RNA的加工。整合分析表明,叶片miRNAs可靶向生物碱合成的b ZIP和b HLH转录因子,而上调的miR482b-3p可靶向uk激酶(能增加SGT2底物—配糖基供体UDP-葡萄糖);miR479则靶向糖苷生物碱合成的CYP450酶(CYP71D7)。4.恰柯薯(S.chacoense,2n=2X=24)是一SGAs含量高,能分离出抗虫、抗病和抗逆基因的二倍体野生种。对红光诱导下的块茎sRNA高通量测序,共鉴定出Group 1的187个已知miRNAs和163个p5/p3 miRNAs,Group 2的204个已知miRNAs和220个p5/p3 miRNAs;共有337个新的miRNAs。其中,有24个高度保守miRNA家族,最大的是miR156。k-means聚类结果表明,恰柯薯光诱导下的miRNAs可划分为9个类群(k1-k9),共呈现出持续上调(k2,k3,k4,k5)、持续下调(k1,k8,k9)、早期上调(k6)和早期下调(k7)四种表达模式,表明光可以动态调控特定miRNAs,这类miRNAs则涉及多种生物学功能和代谢过程。5.降解组测序共检测到恰柯薯miRNAs的1319条特有转录本。靶基因GO功能富集表明,在红光诱导下,更多的miRNAs靶基因的GO功能被富集到TD24(红光持续照射24 h)和TD72(红光持续照射72 h)降解组文库;在TD24文库中,miRNAs生物功能主要富集到细胞凋亡、双信号转导系统、防卫反应和染色质重塑;而在TD72文库中,miRNAs则富集到细胞凋亡、钾离子转运、核黄素的生物合成过程和甾类化合物的代谢。6.sRNA与降解组测序联合分析表明,光敏感型miRNAs可操纵与逆境胁迫相关的MYB4转录因子、热休克蛋白(HSPs)及与ROS调节有关的EBF1/EBF2基因表达量,以实现对逆境的交叉适应性。此外,光敏感型miRNAs可参与植物初生及次生代谢调控。其中,miR390和miR8175异构体能靶向调控四吡咯类物质合成的CPO I氧化酶和CHLP还原酶;miR8033异构体能靶向调控黄酮类物质合成的MYB4转录因子。进一步研究发现,光敏感型miRNAs能调控SGAs合成相关基因。其中,athmiR8175/gma-6300异构体能剪切AMPK激酶,进而磷酸化SGAs代谢相关的HMG-Co A还原酶;miR156-SPLs调控元件则能调控倍半萜类物质的生物合成;miR482则靶向与甾醇类物质代谢相关基因3-β羟甾类脱氢酶/异构酶。此外,zma-MIR2275cp5_2ss14TA17AC和PC-3p-11646_92则能靶向与糖苷生物碱代谢相关的Cytochrome P450和CYP72A58基因。7.以p RS300的衍生载体p RSA-4为基础,构建了35S启动子驱动的植物表达载体p CE35s-miR408和多顺反子表达载体p CE35s-dmiR408;并构建了rbc S启动子驱动的植物表达载体p CEr-miR408和多顺反子表达载体p CEr-dmiR408。用农杆菌介导法对陇薯3号、陇薯6号和费乌瑞它进行遗传转化,通过草甘膦筛选得到p CEr-miR408转化再生植株27个,p CEr-dmiR408转化再生植株16个,采用PCR分别鉴定出18株和13株阳性转基因植株。q RT-PCR分析表明,p CEr-miR408和p CEr-dmiR408转化阳性植株的光合组织中miR408的表达量较以野生型对照(陇薯6号)明显提高,而靶基因VS1的表达量明显降低,这表明miR408与VS1基因的表达呈相反趋势,但对于转化阳性植株光合组织中的SGAs含量仍需进行深入的验证和分析。
【关键词】:马铃薯 糖苷生物碱 miRNAs 高通量测序 功能鉴定
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S532;Q943.2
【目录】:
  • 摘要4-7
  • Summary7-10
  • 缩略语表10-15
  • 第一章 文献综述15-38
  • 1.1 国内外马铃薯生产现状及野生种质资源利用15-17
  • 1.1.1 国内外马铃薯生产现状15-16
  • 1.1.2 马铃薯野生种质资源的研究和利用16-17
  • 1.2 糖苷生物碱的生物学功能及生物合成17-22
  • 1.2.1 糖苷生物碱的种类和其生物学功能17-18
  • 1.2.2 糖苷生物碱的代谢途径的中间产物及其生物合成18-21
  • 1.2.3 马铃薯糖苷生物碱种质资源的研究与利用21-22
  • 1.2.4 影响马铃薯糖苷生物碱含量的因素22
  • 1.3 马铃薯糖苷生物碱的分子调控22-26
  • 1.3.1 马铃薯糖苷生物碱代谢相关基因的研究22-24
  • 1.3.2 糖苷生物碱合成相关基因的共表达及代谢组分析24-26
  • 1.4 植物miRNA的研究概括和进展26-35
  • 1.4.1 植物miRNA的生物合成及作用方式的复杂性26-27
  • 1.4.2 植物miRNA的鉴定、表达分析方法27-28
  • 1.4.3 植物miRNA靶基因的鉴定及验证方法28-31
  • 1.4.4 植物miRNA功能与逆境胁迫31-34
  • 1.4.5 miRNA在植物次生代谢物质中的研究进展34-35
  • 1.5 本研究的目的和意义35-37
  • 1.6 技术路线37-38
  • 第二章 光刺激下马铃薯(Solanum tuberosum L)miRNA与转录组的整合分析38-63
  • 2.1 实验材料38-44
  • 2.1.1 植物材料及处理条件38-39
  • 2.1.2 RNA的提取及检测39
  • 2.1.3 sRNA文库的构建及测序39
  • 2.1.4 转录组文库的构建及测序39-40
  • 2.1.5 sRNA数据的分析及靶基因预测40
  • 2.1.6 光刺激下马铃薯差异表达miRNAs的分析与鉴定40
  • 2.1.7 转录组数据的分析与差异表达基因的鉴定40-41
  • 2.1.8 差异表达基因的GO和Mapman注释41
  • 2.1.9 相关miRNA及其靶基因的qRT-PCR鉴定41-44
  • 2.2 结果与分析44-58
  • 2.2.1 sRNA测序基础数据的分析44-46
  • 2.2.2 马铃薯miRNA的鉴定及其在基因组上的分布46
  • 2.2.3 马铃薯不同器官光响应miRNAs的差异表达分析46-49
  • 2.2.4 马铃薯转录组基础数据的分析49-51
  • 2.2.5 马铃薯光响应基因的转录组和GO功能富集分析51-53
  • 2.2.6 马铃薯光响应基因的Mapman代谢通路的分析53
  • 2.2.7 miRNA和mRNA的联合分析53-58
  • 2.3 讨论58-63
  • 2.3.1 栽培种马铃薯的miRNA的特点及在基因组上的分布规律58-59
  • 2.3.2 光敏感型miRNA参与植物的生物及非生物胁迫59-60
  • 2.3.3 光敏感型基因可调节马铃薯的代谢及糖苷生物碱的合成60
  • 2.3.4 光敏感型miRNA可调控马铃薯的代谢及糖苷生物碱的合成60-63
  • 第三章 光刺激下恰柯薯(Solanum chacoense)miRNA与降解组的整合分析63-84
  • 3.1 实验材料63-65
  • 3.1.1 植物材料及处理条件63
  • 3.1.2 RNA的提取及检测63-64
  • 3.1.3 sRNA和降解组文库的构建64
  • 3.1.4 sRNA数据的分析及靶基因预测64-65
  • 3.1.5 光刺激下马块茎差异表达miRNAs的分析与动态表达65
  • 3.1.6 降解组测序数据的分析65
  • 3.1.7 靶基因功能的注释65
  • 3.1.8 相关miRNA及靶基因的qRT-PCR鉴定65
  • 3.2 结果与分析65-78
  • 3.2.1 sRNA测序基础数据的分析65-68
  • 3.2.2 恰柯薯已知miRNAs和新miRNAs的鉴定68-70
  • 3.2.3 恰柯薯光敏感型miRNA的鉴定及k-means聚类70-71
  • 3.2.4 恰柯薯降解组测序数据的概况71
  • 3.2.5 降解组文库中miRNA靶基因的鉴定与不同样本中剪切位点的分析71-73
  • 3.2.6 光敏感型miRNAs和其靶基因的qRT-PCR验证73-74
  • 3.2.7 恰柯薯miRNA靶基因的GO和KEGG功能分析74-76
  • 3.2.8 恰柯薯光响应miRNA调控网络的构建及功能分析76-78
  • 3.3 讨论78-84
  • 3.3.1 恰柯薯的miRNA的特点及在基因组上的分布规律78-79
  • 3.3.2 光敏感型miRNA涉及植物的非生物胁迫响应79
  • 3.3.3 光敏感型miRNA参与植物逆境交叉胁迫适应性的调控79-80
  • 3.3.4 光敏感型miRNA参与调控植物的初生及次生代谢80-82
  • 3.3.5 恰柯薯miRNA参与调控马铃薯的SGAs的代谢82-84
  • 第四章 rbcS驱动的人工miR408多顺反子表达载体的构建及遗传转化84-117
  • 4.1 实验材料84-85
  • 4.1.1 植物材料84
  • 4.1.2 质粒和菌株84-85
  • 4.1.3 工具酶和试剂85
  • 4.1.4 培养基85
  • 4.2 实验方法85-101
  • 4.2.1 植物材料85-86
  • 4.2.2 感受态细胞的制备及转化86-87
  • 4.2.3 基础载体pRS300的改造87-90
  • 4.2.4 人工amiRNA408的克隆及中间载体的构建90-92
  • 4.2.5 植物表达载体pCE35s-miR408的构建92-96
  • 4.2.6 植物多顺反子表达载体pCE35s-dmiR408的构建96-97
  • 4.2.7 植物表达载体pCEr-miR408的构建97-98
  • 4.2.8 植物多顺反子表达载体pCEr-dmiR408的构建98-99
  • 4.2.9 植物表达载体转化农杆菌99
  • 4.2.10 根癌农杆菌对马铃薯的遗传转化99-101
  • 4.3 结果与分析101-114
  • 4.3.1 pRS300基础载体的改造101-102
  • 4.3.2 人工miR408的克隆102-104
  • 4.3.3 植物表达载体pCE35s-miR408的构建104-106
  • 4.3.4 植物表达载体pCE35s-dmiR408的构建106-107
  • 4.3.5 光合特异性启动子rbcS驱动的miR408表达载体的构建107-110
  • 4.3.6 农杆菌工程菌的获得110-111
  • 4.3.7 马铃薯的遗传转化及转基因植株的鉴定111-113
  • 4.3.8 miR408及其靶基因转录水平的检测113-114
  • 4.4 讨论114-117
  • 4.4.1 影响马铃薯遗传转化的主要因素114-115
  • 4.4.2 过表达miR408可降低叶片中VS酶的转录水平115-117
  • 结论117-118
  • 附表118-138
  • 参考文献138-152
  • 致谢152-153
  • 导师介绍153-155
  • 作者介绍155-157

【参考文献】
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