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《甘肃农业大学》 2018年
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贵州省猪蓝耳病感染与免疫状况及其生物媒介调查研究

华莹  
【摘要】:猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种急性高度接触性传染病,具有较高的发病率和死亡率。近年来,贵州省部分地区规模养猪场陆续发生了疑似PRRS疫情,为更好地预防和控制猪蓝耳病的发生,本研究开展了以下工作:1.贵州省猪蓝耳病免疫状况调查:为弄清贵州养猪场猪蓝耳病免疫状况,本实验采用ELISA方法对2015年至2017年采集的猪血清样本计88146头份进行猪蓝耳病抗体检测,结果:2015年~2017年贵州省9个地区养猪场(户)猪蓝耳病免疫覆盖率平均水平为68.9%,其中种猪场、商品场和散养户分别为100%、82.8%和47.1%;免疫抗体合格率平均为82.2%,其中种猪场、商品场和散养户分别为98.9%、81.9%和59.2%;春、夏、秋和冬季猪蓝耳病免疫合格率分别为81.6%、83.0%、81.9%和82.2%;海拔800m以下、海拔800m~1600m和海拔1600m以上养猪场猪蓝耳病免疫合格率分别为81.1%、82.8%和81.1%。这表明贵州省猪蓝耳病免疫效果较好,但不同类型养猪场(户)存在较大差异,而不同季节和海拔高度对猪蓝耳病免疫效果无明显影响。2.贵州省猪蓝耳病感染情况调查:为弄清贵州省养猪场猪蓝耳病感染情况,本实验通过临床疑似病例的临床症状与病理剖解观察以及采对2015年至2017年采集的猪组织样本计9751头份进行猪蓝耳病病原RT-PCR检测,结果:感染猪具明显的PRRS临床症状和病理变化,即体温升高以及典型的呼吸道与繁殖障碍症状;肺脏肉样病变、脾边缘丘状梗死、雀斑肾和淋巴结呈大理石样变等;猪场(户)疑似病例猪蓝耳病病原核酸检出率平均为26.5%,其中种猪场、商品场和散养户分别为13.0%、26.5%和31.0%;PRRSV经典毒株与变异毒株检出率分别为11.3%和15.2%;春、夏、秋和冬4个季PRRSV核酸检出率分别为17.9%、29.3%、28.2%和26.6%;在PRRSV感染病例中,存在多种病毒二重或多重感染,其中以猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒为主,混合感染率分别为28.4%、25.5%和13.9%。这说明,贵州省养猪场(户)普遍存在PRRSV感染。3.猪蓝耳病病毒贵州株分离鉴定与基因变异分析:为了解猪蓝耳病病毒贵州流行株变异情况,本实验采集疑似PRRS病料组织样本进行病毒分离培养、病毒抗原与核酸鉴定以及GP5基因和NSP2基因克隆测序分析,结果:病料接种后Marc-145细胞可见明显CPE现象,如细胞皱缩、聚集成堆和灶状脱落等;经间接荧光抗体染色,在病料感染细胞中可见到明显黄绿色荧光;RT-PCR扩增可见与预期扩增片段大小一致的PRRSV N基因特异性片段(254bp)和GP5基因特异性片段(603bp);经分析发现GP5基因序列与新近流行PRRSV毒株如JXA1株、HUN4株、CG株和LC0810株的相似度高达97.8%~99.9%,而与早期PRRSV经典毒株如HB-2株、Ch-1a株和VR-2332株的相似度只有88.6%~94.5%,GP5基因编码蛋白存在一定的氨基酸点突变;对扩增得到大小为1064bp的NSP2基因片段进行分析,发现该基因片段与新近流行PRRSV毒株如JXA1株、HUN4株、CG株和LC0810株的相似度为90.1%~99.5%,而与早期PRRSV经典毒株如HB-2株、Ch-1a株和VR-2332株的相似度只有78.1%~88.7%,NSP2基因编码蛋白存在31个aa和59个aa的缺失。这说明,本实验成功分离得到了高致病性PRRSV贵州流行株。4.贵州省猪蓝耳病病毒生物媒介调查:为了解贵州省部分规模养猪场PRRSV生物媒介情况,本研究采集临床发病猪场和临床健康猪场的蚊、蝇和鼠样本,经种类鉴定后提取病毒RNA,以PRRSV N基因特异性引物进行RT-PCR扩增,取阳性样本进行Nsp2基因的扩增与克隆测序,结果显示:贵州规模养猪场的生物媒介主要是三带喙库蚊(1985只,占蚊总数50.1%)、白纹伊蚊(1028只,占蚊总数25.9%)、致倦库蚊(559只,占蚊总数14.1%)、家蝇(1266只,占蝇总数77.2%)和褐家鼠(68只,占鼠总数100%);在8个PRRS临床发病猪场相应有5、5、4、2和1个猪场的三带喙库蚊、白纹伊蚊、致倦库蚊、家蝇和褐家鼠样本检出PRRSV N基因片段,猪场检出率相应为62.5%、62.5%、50.0%、25.0%和12.5%,而临床健康猪场蚊、蝇和鼠样本中均未检出;从三带喙库蚊、白纹伊蚊、致倦库蚊、家蝇和褐家鼠样本中扩增得到的PRRSV Nsp2基因片段序列与从该猪场发病猪病毒完全一致。这提示蚊/蝇/鼠等可携带PRRSV,在PRRS发生与流行上可能发挥重要作用。5.猪蓝耳病病毒在白纹伊蚊体内增殖的可能性研究:为验证白纹伊蚊是否为PRRSV生物性传播媒介,本研究选取PRRSV GY株细胞培养物与等量新鲜猪血混合并吸染白纹伊蚊,采集不同时间段和不同世代蚊虫样本,提取病毒RNA,采用PRRSV N基因特异性引物进行RT-PCR检测,同时固定、超薄切片和电子显微镜观察,结果:吸染PRRSV后0h、6h、12h、18h和24h成蚊样本可检测出PRRSV N基因特异性片段,而吸染PRRSV后30h、36h、42h、48h、5d和7d成蚊样本均未能检测出该片段;吸染PRRSV成蚊的蚊卵在孵育1d、2d、4d、7d幼虫和蛹虫及1d、3d成蚊,均未检测出PRRSV N基因特异性片段;在吸染PRRSV后12h、24h、48h和5d的成蚊样本中均未能观察到PRRSV病毒粒子。这表明,PRRSV不在白纹伊蚊体内进行增殖和世代传递,白纹伊蚊只是PRRSV的一种机械性携带媒介。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S858.28

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