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《甘肃农业大学》 2018年
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激素—生长因子—黏附因子调节系统在牦牛子宫内膜上皮的相关性研究

蒋佳颖  
【摘要】:牦牛作为青藏高原地区重要经济物种资源,其生存环境长期受到高海拔及寒冷因素的严峻挑战。牦牛是季节性发情动物,繁殖能力低下,一般是两年一胎或者是三年两胎。所以牦牛受精卵对于牦牛来说非常珍贵,提高受精卵的附植率是提高牦牛生殖率的重要方式。为了提高牦牛胚胎的附植率,本研究对激素-生长因子-黏附因子调节系统在牦牛子宫内膜上皮细胞上的变化进行研究。主要从以下几个方面的试验进行:(1)牦牛子宫内膜上皮细胞的分离与培养:选取牦牛子宫角后2/3段,并分离出上皮层,利用不同消化方法(胰蛋白酶消化法、Ⅰ型胶原酶消化法、两部酶消化法)对子宫内膜上皮细胞进行消化,利用细胞MTT测试计算细胞消化数量及消化率,评价最佳消化方法。利用差速消化法和差速贴壁法对细胞纯化,并评价出最佳纯化方法。结果显示,两部酶消化法的消化率最高,最佳消化方式为先用0.25%胰蛋白酶消化10min,再用0.25%Ⅰ型胶原酶消化3h。细胞纯化试验中发现,差速贴壁法贴壁30min到35min得到的细胞纯度最高。该试验优化了子宫内膜上皮细胞的分离及纯化,并且得到了高纯度的牦牛子宫内膜上皮细胞。(2)牦牛子宫内膜上皮细胞的鉴定与特性研究:采用纯化后第三代牦牛子宫内膜上皮细胞,利用细胞计数法绘制细胞生长曲线;利用角蛋白18、波形蛋白、PBS对细胞进行免疫组化鉴定;利用福尔根染色对细胞核DNA原位定位;利用秋水仙素法制备染色体并进行核型分析。结果显示,细胞生长曲线类似于“S”型生长曲线,在3-6天细胞数目成对数性生长,平均生长周期为1.5-2天;角蛋白18及波形蛋白表达为阳性、PBS表达为阴性,且角蛋白18的阳性表达率超过99%,证明细胞的纯度非常高;核型分析得到牦牛共30对染色体,其中有29对为长染色体,一对为性染色体。这些足以证明通过试验一中得到的细胞为牦牛子宫内膜上皮细胞。(3)不同浓度的E_2和P_4对牦牛子宫内膜上皮细胞分泌EGF和IGF-1的影响:采用纯化后第三代牦牛子宫内膜上皮细胞,向其中分别添加E_2和P_4两种激素以及混合添加两种激素,作用不同时间后,利用细胞MTT测试和Real-time PCR两种方法检测两种激素对于细胞最佳诱导时间及EGF和IGF-1的最佳表达时间;并向其中分别添加不同浓度的E_2和P_4两种激素以及混合添加不同浓度的两种激素作用最佳诱导时间后,利用间接免疫荧光技术、Real-time PCR、Western-blotting以及ELISA四种方法,检测两种激素对子宫内膜上皮细胞表达EGF和IGF-1的最佳诱导浓度。结果显示,不同种类激素诱导细胞最佳生长时间以及生长因子最佳表达时间均为24h,间接免疫荧光技术、Real-time PCR、Western-blotting以及ELISA四种方法均证明两种生长因子在单一激素诱导下表达量与激素浓度呈现正相关关系,但并不显著,在两种激素同时作用下表达量显著上升,其中最佳表达浓度为E_210ng/mL和P_410ng/mL。本试验发现孕酮和雌二醇联合作用时会有效提高子宫内膜上皮细胞EGF和IGF-1的表达量。(4)不同浓度的EGF和IGF-1对牦牛子宫内膜上皮细胞分泌MUC1和PGF的影响:采用纯化后第三代牦牛子宫内膜上皮细胞,向其中分别添加EGF和IGF-1及其各自受体抑制剂作用不同时间,利用细胞MTT测试和Real-time PCR两种方法检测两种生长因子对细胞最佳诱导生长时间及MUC1和PGF的最佳表达时间;向其中分别添加不同浓度的EGF和IGF-1及各自受体抑制剂作用最佳表达时间,利用间接免疫荧光技术、Real-time PCR、Western-blotting三种方法,检测EGF和IGF-1对子宫内膜上皮细胞表达MUC1和PGF的最佳诱导浓度。结果表明,细胞最佳生长时间以及黏附因子最佳表达时间均为24h,间接免疫荧光技术、Real-time PCR、Western-blotting三种方法均证明MUC1表达量与EGF和IGF-1的浓度呈现负相关关系,在浓度为100ng/mL时表达量最低,与生长因子受体抑制剂浓度呈现正相关关系,最佳浓度为40μΜ/mL;PGF表达量与EGF和IGF-1的浓度呈现正相关关系,最佳浓度为100ng/mL,与两种生长因子受体抑制剂浓度呈现负相关关系,在40μΜ/mL时表达量最低。本试验发现,生长因子可以抑制子宫内膜上皮细胞上MUC1的表达但是可以促进PGF的表达。本试验从分离纯化培养的牦牛子宫内膜上皮细胞上对激素-生长因子-黏附因子调节系统进行研究,并阐明E_2及P_4与EGF和IGF-1与MUC1和PGF之间的表达量诱导关系。具体结论如下:1、牦牛子宫内膜上皮最佳消化方法是两步酶消化法,先用0.25%胰蛋白酶消化10min,再用0.25%Ⅰ型胶原酶消化3h。最佳纯化方法是差速贴壁法贴壁30min。2、通过免疫组化、福尔根染色和核型分析法证明消化纯化得到的细胞是牦牛子宫内膜上皮细胞,并绘制该细胞生长曲线。3、单独使用E_2和P_4都能促进EGF和IGF-1表达,联合使用E_2和P_4时,EGF和IGF-1的表达量显著升高,其中最佳作用浓度E_2为10ng/mL和P_4为10ng/mL联合作用。4、EGF和IGF-1都抑制MUC1的表达,最佳抑制浓度为100ng/mL。其受体抑制剂Gefitinib和BMS-536924都能促进MUC1的表达,最佳促进浓度为40μM/mL。EGF和IGF-1都能促进PGF的表达,最佳促进浓度为100ng/mL。其受体抑制剂Gefitinib和BMS-536924都能抑制PGF的表达,最佳抑制浓度为40μM/mL。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S823.85

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