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《甘肃农业大学》 2018年
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LncRNA和mRNA对仔猪C型产气荚膜梭菌腹泻抗性的调控机制研究

黄晓宇  
【摘要】:仔猪腹泻是养猪业中普遍存在的一种肠道疾病,严重影响养猪业的经济效益。C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C)是引起仔猪腹泻的细菌性病原菌之一,它能够黏附到肠道上皮,并释放多种毒素损伤并破坏肠绒毛、黏膜和内皮细胞等,引起仔猪腹泻。尽管通过疫苗预防和抗生素治疗在一定程度上减少和控制了仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻的发生,但长期使用抗生素导致病原菌耐药性增强,且对食品安全和人类健康带来隐患;病原菌的变异也不断为疫苗的研发提出挑战,使得对仔猪腹泻的防治难度不断加大。LncRNA(long noncoding RNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA,能够激活或抑制蛋白编码基因的表达,在机体防御病原菌感染的过程中发挥重要调控作用。研究已证明lncRNA和mRNA的差异表达与大肠杆菌和沙门氏菌感染导致的仔猪腹泻疾病密切相关,但有关其对仔猪C型产气荚膜梭菌腹泻的调控机制研究未见报道。开展仔猪C型产气荚膜梭菌感染性腹泻抗性的调控机制研究,筛选对仔猪腹泻具有重要调控功能的lncRNA和mRNA,对于从遗传上提高仔猪抗腹泻能力和培育腹泻抗性猪品系具有重大的意义。鉴于此,本研究利用C型产气荚膜梭菌感染7日龄健康二元仔猪,通过总腹泻评分和粪便C型产气荚膜梭菌细菌计数等试验筛选C型产气荚膜梭菌耐受型(IR)和易感型(IS)仔猪;采用RNA-seq和生物信息学方法获得耐受组、易感组和对照组(IC)仔猪回肠组织lncRNA和mRNA差异表达谱;对差异表达lncRNA和mRNA进行功能富集分析;筛选仔猪C型产气荚膜梭菌腹泻抗性相关基因。通过以上研究探索lncRNA和mRNA在C型产气荚膜梭菌感染导致仔猪腹泻过程中的调控机制。主要研究结果如下:1.C型产气荚膜梭菌感染对仔猪的体重、腹泻评分和粪便C型产气荚膜梭菌数量的影响显著,且IR和IS组仔猪之间差异显著。与IC组相比,IR和IS组仔猪的总腹泻评分、粪便细菌数量均上升,体重、心、肝、脾等重量下降;IR组仔猪的腹泻评分、粪便细菌数量显著低于IS组仔猪(P0.05),IR组仔猪的体重、心、肝和脾等重量显著高于IS组仔猪(P0.05)。2.lncRNA和mRNA的表达谱分析结果表明:在IR、IS和IC三组间共发现到3640个lncRNA(1850个新lncRNA和1890个注释lncRNA)和25491个mRNA。与mRNA相比,这些lncRNA具有较低的外显子数、较短的长度、较低的表达量、低保守性和无编码潜能等特征。差异表达分析共筛选出IR、IS和IC三组中有480个差异表达lncRNA和3669个差异表达mRNA,其中4个lncRNA和28个mRNA在IRvsIC、ISvsIC和IRvsIS三对比组中共同差异表达。3.差异表达lncRNA和mRNA的功能富集分析结果显示:与IC组相比,IR和IS组差异表达lncRNA和mRNA富集的功能和信号通路相似,其显著富集的GO功能主要包括细胞功能、转导、受体激活、氨基酸代谢、生物合成和代谢等与细胞和免疫相关的GO功能;其富集的KEGG信号通路主要包括氧化磷酸化、ABC转运、脂肪酸代谢、移植物抗宿主反应疾病等与代谢、分子合成和转运和免疫相关的信号通路。4.筛选出与C型产气荚膜梭菌感染性疾病相关的212个差异表达lncRNA通过cis或trans作用方式及其靶向调控的505个差异表达mRNA关系对,其中25个lncRNA对13个免疫相关基因具有潜在的调控关系。5.IRvsIS组中差异表达lncRNA的功能预测和分析结果表明:IRvsIS对比组中7个差异表达lncRNA的差异表达靶mRNA主要富集在MHC I类蛋白复合体、免疫反应、抗原加工和递呈、I-κB/NF-κB信号的调控等GO功能;以及细胞粘附分子、炎症性肠炎、T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导细胞毒性、细胞因子受体互作等免疫相关的通路。6.qPCR检测结果表明:IR和IS组IRAK3、LCP2和TLR8的表达量极显著低于IC组(P0.01),IS组TNFRSF11A和CYP1A1的表达量极显著高于IC组(P0.01),且IR组和IS组的TLR8和CYP1A1的表达量差异显著(P0.05)。IR和IS组NF-κB和IFN-α表达量显著高于IC组,且IR和IS组之间差异显著,IR组IL-1β和TNF-α表达量显著高于IC组(P0.05)。综上所述,lncRNA可能通过调控其靶基因的表达,影响细胞因子的水平,并通过影响仔猪肠道的能量代谢、受体激活和免疫等功能参与仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染导致的腹泻疾病。本研究可为仔猪C型产气荚膜梭菌腹泻抗性的调控机制和腹泻抗性猪品系的分子辅助育种研究研究提供重要参考。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S858.28

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