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《甘肃农业大学》 2018年
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乙烯对黄瓜外植体不定根发生的影响及其差异蛋白分析

金鑫  
【摘要】:不定根的发育是植物生命周期中一个复杂而重要的过程。乙烯是一种结构较为简单的气态植物激素,能够促进不定根形成。然而,乙烯诱导不定根形成的分子机制仍不清楚。因此,乙烯对不定根发生的调控机制研究具有重要理论与实践意义。本研究以黄瓜(Cucumis sativus‘Xinchun 4’)为材料,通过观察其外植体不定根发生过程解剖结构的变化,确定其三个发育阶段。利用iTRAQ技术获得与不定根发生不同阶段的相关差异表达蛋白(DEPs)。同时,通过iTRAQ技术研究外源乙烯诱导黄瓜外植体不定根发生过程的DEPs,并通过转录水平、Western-blot蛋白半定量和生理生化手段进行验证。最终,探讨黄瓜不定根发生的生理及分子机制,为不定根发生的调控提供理论依据和技术支持。主要研究结果如下:1.采用石蜡切片技术对黄瓜不定根发生过程进行观察,将其划分为三个阶段:不定根原基诱导阶段(IRP;0-12 h),不定根原基的形成阶段(FRP;12-24 h)以及不定根的伸长阶段(EAR;24-72小时)。外源乙烯释放化合物乙烯利(ethrel)可显著促进黄瓜外植体不定根的形成,其中0.5μM促进效果最好。黄瓜不定根的发生被乙烯抑制剂氨基乙氧基乙烯甘氨酸和硝酸银能够抑制,且逆转了ethrel对黄瓜不定根发生的促进作用,表明黄瓜外植体生根过程受乙烯的正调控。2.对黄瓜外植体不定根发生的三个阶段进行了比较蛋白质组学分析,以确定可能参与调控不定根的相关蛋白。在检测到的3622个差异表达的蛋白中,57个已知蛋白被认为与不定根发育相关,其中20个作为候选蛋白。对所鉴定的蛋白进行功能分类,发现在生根过程中这些蛋白质主要与光合作用、碳水化合物和能量代谢、脂代谢、应激反应和氨基酸代谢有关。用实时荧光定量PCR进一步分析了19个差异表达蛋白的转录水平,其中包括脂氧合酶(Lipoxygenase;LOX)和微管蛋白α链(Tubulin alpha chain;TUA),17个基因与iTRAQ的结果一致,占检测蛋白的89%,其中Threonine dehydratase(Csa_6G448740)和Ferredoxin-1(Csa_3G146700)与差异蛋白表达结果不一致。Western blot实验分析显示,LOX和TUA能在黄瓜外植体中正常表达,在三个生根阶段中LOX蛋白表达呈上升趋势,而TUA的表达表现出下降趋势,与差异表达蛋白结果一致。在三个生根阶段中LOX活性与乙烯释放量明显升高,而且不同生根阶段乙烯的释放量与LOX活性密切相关。除此以外,还揭示了细胞周期活性的激活在三个生根阶段中,细胞从G1期转移向S期,同时细胞周期相关基因CycA、CycB、CDKA和CDKB在三个阶段诱导表达。说明LOX和TUA可能参与了不同生根阶段不定根的发育。3.黄瓜外植体不定根发生经乙烯处理影响的差异蛋白分析:在检测到的5014个差异表达的蛋白中,115个已知蛋白被认为与不定根发育相关,其中24个作为候选蛋白Ethrel处理的与对照(蒸馏水)相比,所鉴定到的蛋白质主要涉及到光合的作用、转录的翻译、碳水的化合物和能量的代谢、氨基酸的代谢和蛋白质的折叠修饰,这几类的功能范畴在乙烯诱导不定根的形成过程中发挥重要作用。在转录水平上进一步分析了23个差异表达的蛋白,包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase;SAMS)和ATP合成酶α亚基(ATP synthase subunitα,chloroplastic;AtpA),其中18个与iTRAQ的结果一致,占检测蛋白的78%,另外Aspartokinase(Csa_5G457770),Folylpolyglutamate synthase(Csa_5G630860),Methionine aminopeptidase(Csa_2G172500)和Serine/threonine-protein phosphatas(Csa_6G426880)的mRNA水平与蛋白表达模式不同。Western blot实验分析显示,在黄瓜外植体中能检测到SAM和AtpA正常表达,乙烯处理提高了SAMS和AtpA的蛋白表达。ACO和ACS酶活性和编码这两个酶基因的相对表达与乙烯的释放量在乙烯处理后有着相似的变化趋势。在诱导阶段和形成阶段显著增加乙烯释放量、ACO、ACS酶活性,上调ACO1、ACS2的基因表达量。乙稀处理显著增加乙稀合成酶活性及其基因和受体的基因表达,说明促进了内源乙稀的合成,从而促进不定根的发生。黄瓜外植体中的叶绿素含量、叶绿素荧光参数(Fv/Fm、ΦPSII、q P)、光合酶(Rubisco、GAPDH、FBPase、FBA和TK)活性和编码相关酶的基因(rbc S、GADPH、FBA和TK)相对表达水平经乙烯处理后得到提高,可溶性蛋白和可溶性糖含量提高,而且减少外植体淀粉。这些物质通过相互的作用,有着相对规律的变化,协同调节和控制不定根的形成。因此,推测乙烯的合成前体SAMS直接参与了不定根的发育调控。同时,AtpA可能与不定根的发育成正相关。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S642.2

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