收藏本站
《甘肃农业大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

CRISPR/Cas9介导的双峰驼转基因细胞的构建及其用于iPS细胞诱导的探索

李宗帅  
【摘要】:双峰驼作为我国西北地区特有物种,由于环境等诸多因素的影响,野生双峰驼的数量正在急剧减少。选择合适的方法对其种质资源进行保护具有重要的意义。考虑到双峰驼较为特殊是生理特性,利用诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)保护双峰驼的遗传资源是可行的,但iPS细胞的分离方法较为繁琐复杂。CRISPR/Cas9技术是最新的一种基因编辑技术。CRISPR全称为规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats9,CRISPR)。理论上可实现全基因组的基因切割,并在多个物种上得到了证实。结合以上两种比较成熟的技术,本试验成功构建了双峰驼转基因细胞,为后期优化筛选iPS细胞的方法提供了生物材料,并对其诱导为iPS细胞的条件进行了初步探索,主要结果如下:1、表达载体的构建根据Nanog基因只在多能性细胞中表达的现象设计了上下游同源臂,长度分别是2341bp和1775bp。同时,克隆了eGFP基因和neo基因。本试验先将上、下游同源臂连入到pUC,然后连入具有真核启动子的neo基因,最后连入eGFP基因,成功获得了表达载体pUC-up-eGFP-pgk-down。2、切割载体的构建利用在线软件,根据20+NGG的原则在Nanog基因的终止密码子附近设计了三对sgRNA。将其连入到pX330-eGFP中。3、双峰驼转基因细胞的获得将三对切割载体转染到双峰驼胎儿成纤维细胞中,利用T7E1酶切检测各自的切割效率。选取切割效率最高的切割载体和表达载体共转染双峰驼胎儿成纤维细胞,通过G418筛选,获得基因敲入成功的细胞,并将其用于后续的iPS细胞诱导。4、双峰驼转基因细胞诱导为iPS细胞条件的探索用逆转录病毒将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个基因转入到双峰驼转基因细胞中,用不同培养方案在低氧环境下进行诱导培养。16d后对其进行碱性磷酸酶检测,表明诱导条件尚需优化。综上所述,本试验在双峰驼胎儿成纤维细胞的Nanog基因后定点敲入了两个基因(eGFP基因和具有真核启动子的neo基因)。成功构建了双峰驼转基因细胞,为后期优化筛选iPS细胞的方法提供了生物材料,并对其诱导为iPS细胞的条件进行了初步探索。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q78;S824

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴琳;;三种生物活性陶瓷材料对iPS细胞增殖的影响[J];科教文汇(下旬刊);2018年03期
2 ;国际舞台上中国干细胞研究专家2010年4~5月的成果[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年27期
3 ;国际舞台上中国干细胞研究专家2010年6~7月的成果[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年32期
4 黄晓江;胡文涛;盛鑫;黄梁江;张苏明;;昆明小鼠iPS细胞传代培养方法的优化研究[J];神经损伤与功能重建;2013年05期
5 徐天慧;林颖;梁栋;王霞;胡平;许争峰;;通过患者来源iPS细胞建立阵挛性癫痫伴破碎红纤维综合症心肌细胞疾病模型[J];临床检验杂志;2018年02期
6 战智琰;李彦欣;;iPS细胞技术在HIV研究和治疗中的应用[J];中国艾滋病性病;2018年05期
7 陈文;毛志勇;;iPS细胞基因组稳定性调控的分子机制[J];中国基础科学;2017年02期
8 ;国际舞台上中国干细胞研究专家2010年9~12月的学术成果[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年36期
9 ;国际舞台上中国干细胞研究专家2010年12月~2011年1月的学术成果[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年40期
10 范文娟;马永超;陈旭东;袁磊;饶淑梅;王福青;;维甲酸诱导小鼠iPS细胞向神经细胞分化[J];神经解剖学杂志;2015年01期
中国重要会议论文全文数据库 前2条
1 邱家俊;刘艳娜;刘霞;任兆瑞;颜景斌;曾凡一;;唐氏综合征iPS细胞中IncRNA表达改变对线粒体功能影响的研究[A];2017中国长三角遗传学大会会议手册[C];2017年
2 叶金海;吴煜农;江宏兵;张陈平;王林;Jake Chen;;Osterix修饰的iPS细胞诱导颅骨组织再生的研究[A];第十次全国老年口腔医学学术年会论文汇编[C];2015年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 记者 华义;iPS细胞“异体移植”首次出现并发症[N];科技日报;2018年
中国博士学位论文全文数据库 前7条
1 陈焱;基于iPS细胞和纳米纤维支架的组织工程心肌构建研究[D];第四军医大学;2017年
2 段学静;釉基质蛋白在体外对诱导性多能干细胞的作用及其共同在牙周再生中的应用[D];山东大学;2010年
3 孙璇;胚胎干细胞或胚胎样干细胞向血管细胞的分化及调控机制研究[D];中南大学;2010年
4 雷蕾;山羊体细胞重编程及其转分化研究[D];西北农林科技大学;2013年
5 黄馨;端粒缩短影响原发性高血压及其并发症的发生[D];北京协和医学院;2010年
6 欧东波;iPS细胞诱导分化及组织工程心肌构建的研究[D];第四军医大学;2012年
7 闫秋月;控制性叶酸剥夺法诱导小鼠iPS细胞的研究[D];华中科技大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李宗帅;CRISPR/Cas9介导的双峰驼转基因细胞的构建及其用于iPS细胞诱导的探索[D];甘肃农业大学;2018年
2 刘雅丽;ssODNs结合小分子化合物对β-地中海贫血病人特异iPS细胞系基因修复的研究[D];广州医科大学;2017年
3 孙红艳;小鼠支持细胞重编程为诱导多能干细胞的研究[D];南京农业大学;2013年
4 高庭;用于诱导多潜能性干细胞的人羊水细胞培养及逆转录病毒包装平台的建立[D];中南大学;2010年
5 杨淑娇;基于文献合著的iPS细胞领域知识网络研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2017年
6 刘小梅;毛囊源性iPS细胞经定行内胚层诱导为肝细胞样细胞的研究[D];吉林大学;2016年
7 吴翠玲;体内诱导iPS细胞向胸腺上皮细胞分化的研究[D];南方医科大学;2016年
8 孟书燕;小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用[D];西北农林科技大学;2011年
9 邱峰龙;利用特定转录因子的mRNA诱导获得山羊iPS细胞的研究[D];扬州大学;2014年
10 周承亮;人Oct4蛋白诱导神经干细胞为iPS细胞的初步研究[D];浙江理工大学;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026