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《甘肃农业大学》 2018年
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猪δ冠状病毒的分离、鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立

肖帅  
【摘要】:猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种能够引起猪严重水样腹泻、呕吐及脱水的猪肠道冠状病毒。PDCoV基因组为单股正链RNA,与PEDV基因组结构相似,基因组大小为25.4 kb,包含5′和3′非翻译区及7个开放性阅读框。随着PDCoV在全球范围内的不断流行和演化,给猪腹泻病的防控带来了新的挑战。因此,广泛收集、鉴定PDCoV流行毒株,建立相应的快速诊断方法对有效地预防和控制PDCoV具有重要意义。本研究收集了国内多个省份的猪腹泻样品,并对PDCoV阳性的腹泻样品进行了病毒分离与鉴定,为全面了解国内PDCoV流行情况及研制新的、有效防控产品积累了材料和基础。此外,本研究还建立了一种以TaqMan实时荧光定量PCR为基础的PDCoV快速检测方法,为PDCoV的临床快速诊断提供有效而准确的方法。(1)PDCoV病毒的分离鉴定:在2016、2017年间从河南、新疆、黑龙江等国内9省区采集了608份腹泻粪便样品。利用RT-PCR对样品进行了检测并测序,并通过将8份PDCoV阳性样品在LLC-PK1细胞上的体外适应性传代培养,成功分离获得了一株细胞适应毒株CH/HNZZ27/2016。利用噬斑试验对该毒株进行纯化后成功传至30代(P_(1-30)),并通过PCR、免疫荧光试验、电子显微镜等对传代毒进行了鉴定。经PCR扩增P_5、P_(10)、P_(15)、P_(20)、P_(25)、P_(30)的细胞培养物均有明显条带,经测序证实均为PDCoV。免疫荧光检测结果表明,P_(30)在接毒24 h后可以检测到呈现绿色荧光的PDCoV抗原。理化性质分析表明,该毒株对热敏感,对氯仿不敏感,并且在pH3的环境下容易失活。病毒滴度测定结果表明,P_(30)代细胞培养物的半数组织感染量为10~(-6.4)TCID_(50)/0.1 m L。通过对S基因的核苷酸和氨基酸序列分析表明,该毒株的S基因与中国的CH-01、CHJXN12毒株和香港HKU15-144、HKU15-155以及美国的lllinois133、lllinois134、IOWA136、Minnesota 140和Ohio137毒株在同一进化分支;与泰国的S5022、S5024不在同一进化分支中。(2)PDCoV TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立:利用已公布的PDCoV N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果表明,以猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)、猪库布病毒(Porcine Kobuvirus,PKV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive Respiratorysyndrome,PRRS)和口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)为模板时,均未检测到荧光信号,说明该方法具有良好的特异性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/μL 3个不同浓度的质粒标准品进重复实验,循环阈值Ct的变异系数均低于2%,表明该方法具有良好的重复性;标准曲线斜率为-3.461,相关系数为R~2=0.998,表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品,检测的最低限度为2.66×10~1 copies/μL的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对194份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为22.1%,明显高于常规RT-PCR的11.9%,表明该方法可应用于PDCoV的临床诊断及定量检测。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.651

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