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《甘肃农业大学》 2018年
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高原甘加藏羊发情周期下丘脑GnRH的动态分泌及其受体在垂体和卵巢中表达

葛闻博  
【摘要】:雌性动物的生殖活动主要受下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamic-pituitary-ovary axis)的调控,促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)作为下丘脑-垂体-卵巢轴的关键信息分子,它可以直接作用于垂体和卵巢分别调控促性腺激素(Gonadotropic hormone,GTH)和卵巢类固醇激素的分泌来调控母畜的发情、排卵等生殖过程。GnRH对生殖功能的调控必须以促性腺激素释放激素受体(Gonadorelin releasing hormone receptor,GnRHR)为介导。因此,掌握甘加藏羊发情周期下丘脑GnRH的动态分泌及其受体在垂体和卵巢中的分布和基因表达的动态变化规律。为研究生殖激素调控甘加藏羊的生殖生理活动提供了理论依据。为了探究高原甘加藏羊发情周期下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)及其受体(GnRHR)在生殖调控活动中的作用。本试验对甘加藏羊发情周期不同阶段血浆中GnRH的分泌及垂体和卵巢组织中GnRHR的分布、GnRHR mRNA表达的动态变化规律进行了研究。试验选取年龄2.5~3.5岁,发育正常的未孕雌性高原甘加藏羊48只,根据发情周期四分法将高原甘加藏羊分为4组:发情前期、发情期、发情后期和间情期。采集藏羊血液、垂体及卵巢组织。(1)利用酶联免疫吸附试验(ELISA),测定高原甘加藏羊发情周期各阶段血浆中GnRH的含量,分析其在发情周期的动态变化规律;(2)利用荧光定量PCR(RT-PCR)技术,检测高原甘加藏羊发情周期各阶段垂体和卵巢组织中GnRHR mRNA的动态表达规律;(3)利用HE染色法观察高原甘加藏羊发情周期各阶段垂体和卵巢组织结构变化特点;(4)利用免疫组织化学SP法,对高原甘加藏羊发情周期各阶段垂体和卵巢组织中GnRHR阳性细胞的分布表达进行研究,并结合计算机图像分析软件(Image pro-plus)对藏羊发情周期各阶段垂体和卵巢组织中GnRHR免疫反应阳性产物的积分光密度值进行分析。研究结果如下:1.高原甘加藏羊发情周期不同阶段下丘脑GnRH分泌呈现一定的规律:血浆中GnRH的含量在间情期分泌量最低(55.687pg/ml),之后分泌量开始增加,发情前期(57.409pg/ml),发情期升高达到最大(73.389pg/m),发情后期分泌量减少(62.058pg/ml),其中发情期分泌量最多且与其他三个时期差异显著(P0.05)。发情期和发情后期呈脉冲式分泌,间情期和发情前期既有脉冲式又有波动式分泌。2.高原甘加藏羊垂体组织中GnRHR mRNA在发情前期、发情期、发情后期和间情期的相对表达量分别是0.8246±0.1739、1.5100±0.4187、0.2923±0.0202、1.0000±0.2100,其中发情期的相对表达量最高,较发情后期差异极显著(P0.01),与发情前期和间情期差异显著(P0.05)。卵巢组织中GnRHR mRNA按照发情周期的相对表达量分别是1.0910±0.7665、0.5420±0.0763、1.3799±0.7452、1.0000±1.1221,其中发情后期的相对表达量最高,与发情期差异极显著(P0.01),与发情前期和间情期差异显著(P0.05)。3.HE染色观察显示,(1)甘加藏羊垂体根据胞浆染色不同,可辨别出三种类型细胞,垂体细胞胞浆被染成红色的为嗜酸性细胞,体积较大,圆形;胞核被染成紫色的为嗜碱性细胞,体积最大,圆形或卵圆形;嫌色细胞着色较浅,体积小,形状不规则。甘加藏羊从发情前期、发情期、发情后期嗜碱性细胞着色数量逐渐增多,在间情期降低;嗜酸性细胞在发情前期和发情期着色数量较少,在发情后期和间情期着色数量较多;嫌色细胞没有完整的细胞颗粒,在发情前期和间情期较多。(2)原始卵泡主要位于皮质浅层,体积小,细胞界限不明显。初级卵泡卵泡细胞界限明显,围绕着初级卵母细胞。次级卵泡位于卵巢皮质较深处,卵泡的体积增大,卵泡细胞增至多层围绕着次级卵母细胞。三级卵泡位于髓质,卵泡细胞分裂为更多层颗粒细胞,细胞界限清晰,出现卵泡腔,里面充满了卵泡液。成熟卵泡位于卵巢表面,体积最大,卵泡腔随之增至最大,充满卵泡液,此时透明带和放射冠更明显。闭锁卵泡的卵母细胞萎缩变形无规则。黄体细胞体积较大,细胞和周围组织界限清晰,胞质着色较深。4.免疫组织化学检测结果显示:(1)高原甘加藏羊发情周期的各个阶段GnRHR免疫反应阳性细胞主要分布在垂体远侧部,在发情期GnRHR阳性细胞数量分布最多,细胞多为圆形;发情后期和间情期阳性细胞数量较少,细胞呈卵圆形;发情前期阳性细胞相对较多,形状不规则。应用计算机图像分析软件(IPP)得出,甘加藏羊发情周期垂体中GnRHR免疫阳性细胞积分光密度值在发情前期、发情期、发情后期和间情期分别为:9126874.8624±39582.6795、9628562.0168±49365.2516、7486923.0574±52684.8536、7395086.6842±49572.8143,发情期最高,与发情后期和间情期相比差异极显著(P0.01),发情前期与发情后期和间情期差异显著(P0.05)。(2)高原甘加藏羊发情周期的各个阶段GnRHR免疫反应阳性细胞在各级卵泡的卵母细胞、卵泡细胞、卵泡的颗粒层、卵泡膜和黄体上有分布,在卵泡周围基质细胞中也有免疫阳性反应。根据IPP软件分析得到,甘加藏羊发情周期卵巢中GnRHR免疫阳性细胞积分光密度值在发情前期、发情期、发情后期和间情期分别为:869625.1954±6921.2894、895264.6931±6137.9752、973841.3840±5941.3698和897316.2547±5723.4618,发情后期最高,与发情期、发情前期和发情间情差异极显著(P0.01),发情前期、发情期和间情期差异不显著(P0.05)。结论:高原甘加藏羊发情周期血浆中GnRH的含量在间情期分泌量最低,发情期分泌量最高。垂体组织中GnRHR mRNA在发情期的相对表达量最高;卵巢组织中GnRHR mRNA在发情后期的相对表达量最高。垂体组织中GnRHR免疫反应阳性细胞主要分布在远侧部,在发情期分布密度最高。GnRHR阳性细胞分布在各级卵泡的卵母细胞、卵泡细胞、卵泡颗粒层、卵泡膜、黄体。GnRHR的免疫阳性产物的积分光密度值在发情后期最高。上述研究结果,可为进一步研究高原甘加藏羊下丘脑生殖激素对不同发育时期垂体、卵泡的作用和繁殖性能的影响,提供了包括激素、分子和细胞水平的理论依据。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S826

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