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《甘肃农业大学》 2018年
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虹鳟热应激相关两个新miRNA靶基因验证及功能分析

刘晓霞  
【摘要】:虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是一种在北方地区广泛养殖的冷水性鱼类,对高温具有低耐受性和高敏感性,随着虹鳟养殖业集约化、规模化的发展,虹鳟在夏季面临的生存考验愈加严峻,很易因热应激造成大面积死亡或减产。课题组前期通过高通量测序研究虹鳟热应激前后(18℃和24℃)差异表达的miRNA时发现,在虹鳟头肾中存在两个未知mi RNA,其在热应激前后差异表达极显著(~(**)P0.01),分别暂命名为novel-434和novel-242(novel-434和novel-242均为测序所得novel miRNA数据库中miRNA的排序)。通过miRNA靶基因预测软件mi Randa对其靶基因进行预测分析,发现novel-434和novel-242分别负向调控重要的靶基因HSPA4L和CRT。鉴于此,本研究选择HSPA4L作为novel-434待验证的靶基因,CRT作为novel-242待验证的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统验证其靶标关系,并通过GO注释和KEGG分析其功能和调控机制。具体试验结果及结论如下:1.成功克隆pmirGLO-HSPA4L 3'-UTR和pmirGLO-CRT 3'-UTR及其突变载体pmirGLO-mut-HSPA4L 3'-UTR和pmirGLO-mut-CRT 3'-UTR,并确定较好的转染体系,为进一步的细胞试验提供依据。在转染至HEK 293T细胞48 h后,在转染重组载体质粒pmirGLO-HSPA4L 3'-UTR的试验中,与mimics NC组相比较,novel-434 mimics组荧光素酶活性下调且差异极显著(5.69倍,~(**)P0.01);转染重组载体质粒pmirGLO-mut-HSPA4L 3'-UTR的试验中,与mimics NC组与novel-434 mimics组差异不显著(P0.05);在转染重组载体质粒pmirGLO-novel-434的试验中,与mimics NC组相比较,novel-434 mimics组荧光素酶活性下调且差异极显著(~(**)P0.01),以上试验结果说明miRNA novel-434与HSPA4L存在靶向关系,novel-434能与靶基因HSPA4L的3'-UTR区域通过部分序列互补的方式靶向调控,novel-434是虹鳟头肾中与热应激相关的mi RNA,通过对热休克蛋白基因HSPA4L的转录后抑制作用,参与调节虹鳟热应激的发生过程。2.转染48 h后,在转染重组载体质粒pmirGLO-CRT 3'-UTR的试验中,mimics NC组与novel-242 mimics组荧光素酶活性差异不显著(P0.05);在转染重组载体质粒pmirGLO-mut-CRT 3'-UTR的试验中,mimics NC组与novel-242-mimics组差异不显著(P0.05);在转染重组载体质粒pmirGLO-novel-242的试验中,与mimics NC组相比,pmirGLO-novel-242荧光素酶活性下降且差异极显著(~(**)P0.01),说明novel-242不能与生物信息学预测的靶基因CRT的3'-UTR区域靶向互补结合。3.novel-434通过靶向作用于热休克蛋白基因HSPA4L来参与调控虹鳟热应激过程,GO注释显示,HSPA4L参与细胞组分与合成、发育和细胞代谢等11种生物学过程;KEGG富集分析表明,HSPA4L在内质网蛋白加工通路的内质网相关降解途径(ERAD)中富集,从而促进受损蛋白质的降解,参与调控机体热应激下的适应性保护。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S917.4

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