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《甘肃农业大学》 2018年
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牛支原体PDHc-E2的原核表达及融合蛋白细胞黏附特性研究和单克隆抗体的制备

张懿  
【摘要】:牛支原体是牛的一种重要的致病性支原体,其可在宿主体内持续存在,并引起牛的肺炎、乳腺炎、关节炎等多种疾病,给世界养牛业造成巨大经济损失。因此,开展牛支原体感染相关的研究,将会为牛支原体有效诊断方法和防控措施的研究奠定基础。基于此,本研究开展并完成了如下工作:1.牛支原体武威分离株pdhc基因的克隆、序列分析及原核表达参照GenBank中HB0801株的pdhc基因(CP002058.1)设计特异性引物,扩增获得牛支原体武威分离株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,设计引物,应用Overlap PCR技术对该基因进行优化,进而将优化后的pdhc基因进行克隆表达。结果表明:牛支原体武威分离株pdhc基因CDS全长735 bp,其核酸序列高度保守,与牛支原体国内分离株序列完全一致,与其它种属支原体同源性低于50%;该基因共编码245个氨基酸,无跨膜区,无信号肽,在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 kD。2.牛支原体武威分离株rPDHc-E2抗血清的制备及亚细胞定位将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并应用ELISA、Western blot和免疫荧光试验分别对PDHc-E2在牛支原体中的分布进行了分析。结果显示,rPDHc-E2具有较高的免疫原性,其抗血清效价高达1:100 000;ELISA和Western blot结果显示PDHc-E2蛋白在牛支原体膜和胞浆中均有分布,免疫荧光试验进一步证实了PDHc-E2蛋白在牛支原体膜表面的分布。3.rPDHc-E2抗血清的体外杀菌试验及PDHc-E2对EBL细胞的黏附作用分析本研究通过rPDHc-E2抗血清体外杀菌试验进一步验证PDHc-E2蛋白在牛支原体膜表面的分布及抗体的特异性,通过细胞黏附及黏附抑制试验、入侵及入侵阻断试验分析该蛋白的细胞黏附功能。结果表明:rPDHc-E2抗血清杀菌率为45.86%;且该抗血清可有效抑制牛支原体对EBL细胞的黏附,黏附抑制率为42.85%;同时该蛋白在抑制牛支原体对宿主细胞的入侵方面发挥了一定的作用,入侵阻断率达29.71%,从而表明PDHcE2蛋白与牛支原体对宿主细胞的黏附密切相关。4.牛支原体武威分离株PDHc-E2单克隆抗体的制备及鉴定重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,并采用淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术制备PDHc-E2单克隆抗体,且对筛出的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚型进行鉴定。结果表明:筛选出的杂交瘤细胞株能分泌抗牛支原体特异性抗体且其亚型为IgG1型,轻链为κ型。本研究对牛支原体武威分离株PDHc-E2进行原核表达、细胞黏附特性研究以及单克隆抗体的制备,为进一步研究PDHc-E2的生物学功能奠定了理论基础,同时为牛支原体检测方法的研究提供了生物材料。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.62

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