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《甘肃农业大学》 2018年
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感染ORFV后小鼠骨髓源DCs的免疫学及蛋白质组学分析

杜国玉  
【摘要】:羊口疮(Orf),又名羊传染性脓疱性皮炎,是由羊口疮病毒(Orf Virus,ORFV)引起,主要感染山羊和绵羊的一种急性、接触性人畜共患传染病,ORFV具有强大的宿主免疫调节功能,可以通过编码大量的免疫调节蛋白作用于宿主免疫或炎症反应通路实现对宿主的免疫调节作用。树突状细胞(Dendritic Cell,DC)是目前发现的功能最强大的抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cells,APC),在连接固有免疫和适应性免疫中起着重要作用。然而ORFV是否能感染小鼠骨髓源DCs以及感染后对其产生的影响目前尚不清楚,故本试验以ORFV感染的小鼠骨髓源DCs为靶标,通过表达ORFV129蛋白、制备兔多抗血清,为间接免疫荧光检测技术验证ORFV感染小鼠骨髓源DCs提供特异性抗体;然后通过表面标志物检测ORFV感染是否促进DCs细胞的分化和成熟;最后对ORFV感染前、后引起DCs的差异蛋白质组学进行了分析。本研究的实施为成功分离小鼠骨髓源DCs提供了研究平台,也为进一步揭示ORFV感染宿主的免疫机制研究奠定基础。取得的结论如下:1.成功获得了效价为1:3200的兔多抗血清;2.成功制备了纯度较高的DCs,ORFV刺激DCs时能促进DCs的成熟:无菌分离、培养健康Balb/c鼠骨髓源DCs,第6d经细胞因子诱导的小鼠骨髓细胞在光学显微镜下可观察到细胞表面出现明显毛刺;ORFV(10~(-1))刺激组的细胞表面标记物MHC-Ⅱ、CD86、CD40表达率均明显高于对照组;IL-12、IL-1β、TNF-α、IL-6、INF-γ细胞因子的表达均明显增高,IL-10的表达水平降低;ORFV(10~(-1))刺激组DCs吞噬FITC-dextran的能力明显低于对照组;另外,经病毒处理的DCs与不同比例T淋巴细胞作用后均可见T淋巴细胞的增殖;3.采用iTRAQ技术结合LC-MS/MS质谱鉴定法对ORFV刺激前、后引起DCs的差异表达蛋白进行鉴定分析,共发现191个差异蛋白,其中134个上调蛋白(Scin等),57个下调蛋白(Npl、Cstb等)。差异蛋白主要参与抗原加工与呈递、细胞生物合成、翻译、免疫反应、防御外界刺激等生物过程;KEGG Pathway显著性富集分析表明,差异蛋白主要参与主要为抗原加工提呈途径、核糖体合成途径、胞质DNA-sensing通路、谷胱甘肽、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及一些疾病发生等过程;4.分别利用抗Scin、Npl及Cstb蛋白一抗和HRP标记鼠二抗进行WB验证,印迹图显示,一个上调蛋白和两个下调蛋白与iTRAQ蛋白质组学技术得到的结果一致。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.65

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