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《甘肃农业大学》 2018年
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猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

刘岳  
【摘要】:猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的冠状病毒,主要引起仔猪腹泻,呕吐和脱水。PDCoV自2012年在中国香港首次报道以来在世界多国迅速扩散,给养猪业造成了巨大的经济损失。由于该病毒在近几年新发,尚无有效的疫苗及商品化的检测、诊断方法和试剂盒。本研究旨在利用表达纯化PDCoV N蛋白建立一种检测该病原抗体的间接ELISA检测方法,为临床上检测、诊断PDCoV感染提供有效的依据。为获得高纯度PDCoV N蛋白,本研究从PDCoV cDNA中利用PCR技术扩增获得N基因的核酸,目的片段经酶切处理后克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序验证后命名为rPDCoV-N。将重组质粒rPDCoV-N转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析及Western-blot鉴定。结果表明,目的蛋白在表达体系中被成功表达,其蛋白分子量大小为50.4 KDa。此后,对IPTG诱导浓度、诱导温度及表达时间等进行优化,并采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。结果表明,本研究获得了大量高纯度PDCoV N蛋白,可用作本研究ELISA的包被抗原。采用纯化的重组N蛋白为包被抗原,PDCoV感染的阳性猪血清为一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG为二抗,建立了检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。此后,本研究从抗原包被浓度、包被温度、封闭液浓度及封闭时间、一抗稀释度及孵育时间、二抗稀释度及孵育时间、显色时间等方面对ELISA检测条件进行了优化,获得了如下最佳反应条件:抗原的最佳包被量为100 ng/孔,抗原的最佳包被温度及时间为4℃、1h,最佳封闭物浓度、温度及时间分别为2.5%BSA、37℃、1h,一抗最佳稀释度为1:25,一抗最佳孵育时间为37℃1.5h,二抗最佳稀释浓度为1:5000,二抗的最佳孵育时间为1.5h,最佳显色时间为5min。由此可见,本研究已初步建立了基于PDCoV-N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,为临床上对猪群PDCoV感染的监测和流行病学调查提供了技术保障。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.651

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