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《甘肃农业大学》 2018年
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牛支原体免疫相关膜蛋白及宿主细胞内与牛支原体感染相关蛋白的筛选和鉴定

李丹  
【摘要】:牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)是牛的一种重要的致病性支原体,其感染可引起牛的肺炎、乳腺炎、耳炎、生殖障碍、关节炎、脑膜炎以及角膜结膜炎等多种慢性疾病。由于缺乏感染早期有效的的诊断方法及临床上耐药菌株的不断出现,使牛支原体相关疫情的防控难度不断增加。此外,生物被膜的形成以及表面抗原的高频率变异,可使牛支原体的抵抗力显著增强和有效实现免疫逃逸,并因此可能导致其长期的持续感染状态,从而增加了其他病原生物混合或继发感染的可能性,致使损失加剧。因此,筛选和鉴定牛支原体膜表面免疫原性蛋白及牛支原体感染相关蛋白,将为牛支原体致病机理和免疫机制的研究以及牛支原体相关疾病诊断方法的研发奠定基础。故本研究完成了如下的研究工作:1.牛支原体武威株免疫相关膜蛋白免疫沉淀(IP)以培养至对数中后期的的牛支原体武威株全菌免疫新西兰白兔,制备全菌多克隆抗体;应用硫酸铵-辛酸法纯化抗血清中的IgG,并测定纯化后IgG的效价;提取牛支原体膜蛋白,定量后取适量膜蛋白加入一定量纯化的抗牛支原体全菌的IgG,在抗原抗体充分结合后,加入适量Protein A Sefinose,形成Protein A Sefinose-抗体-抗原复合物,充分洗涤除去未结合的的蛋白质后,将复合物进行质谱分析;结果显示,共筛选出158种具有免疫原性的牛支原体膜蛋白。2.EBL细胞(EBL)膜蛋白与牛支原体膜蛋白免疫共沉淀(CO-IP)提取EBL细胞膜蛋白及培养至对数中后期的牛支原体膜蛋白,并将两者混匀,加入纯化后的牛支原体武威株全菌多抗IgG分子使其充分反应,形成抗体-抗原-互作蛋白复合物,进而将Protein A Sefinose与复合物结合,充分洗涤除去未结合的杂蛋白,所得产物应用液质串联质谱分析。结果显示,共筛选出40种可以与牛支原体膜蛋白发生互做的EBL细胞蛋白,其中细胞膜蛋白为18种,线粒体膜蛋白为11种,内质网膜蛋白为11种。3.牛支原体NOX1基因的克隆表达、酶学活性及其亚细胞定位研究以IP筛选的免疫相关膜蛋白NOX-1为目标蛋白,参照GenBank中Mb HuBei株NOX-1基因序列(GenBank登录号:NC_015725.1)设计引物,应用PCR扩增Mb武威株的NOX-1基因,在完成测序后构建原核表达载体pET-NOX-1,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经纯化后进行酶活测定及多克隆抗体的制备,继而应用Western blot及间接ELISA对NOX-1在Mb内的分布进行了初步定位。结果显示,Mb武威株NOX-1基因全长1 365 bp,且经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,该重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,且其分子量约为50 kDa;重组蛋白酶促活性最适酶促温度为30℃、pH为7.5,双倒数法求得重组蛋白Km和Vmax分别为256.41μmol/L、34.25μmol/(L·min);Western blot及间接ELISA结果表明NOX-1在Mb细胞膜上和细胞浆中均有分布且胞浆含量较高。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S858.23

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