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《甘肃农业大学》 2020年
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大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染BEECs对细胞凋亡相关因子表达的影响

朱辰飞  
【摘要】:奶牛(Bostaurus)子宫内膜炎会对奶牛繁育能力造成显著影响,制约奶牛业发展。产后细菌感染是引起子宫内膜炎发生的首要病因,研究表明细菌的感染会引发细胞凋亡(Apoptosis),从而对疾病的发展过程产生影响。为了研究大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine Endometrial epithelial cells,BEECs)对相关细胞凋亡因子Bax、Caspase-3和Bcl-2的影响,主要通过以下几个实验进行研究:(1)奶牛子宫内膜上皮细胞的分离与培养:利用两步酶消化法体外培养得到BEECs,差速贴壁法30 min纯化细胞,再用含有10%FBS的细胞培养液培养细胞,并进行免疫细胞化学鉴定;(2)以相应感染复数(multiple of infection,MOI)的不同浓度E.coli和S.aureus感染BEECs,利用TUNEL试剂盒检测感染引发的细胞凋亡;(3)在大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染细胞12h后,利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测BEECs中细胞凋亡相关基因Bax、Caspase-3和Bcl-2的mRNA水平。(4)采用纯化后第6代的BEECs,以相应感染复数的不同浓度E.coli和S.aureus(0、10~3、10~4、10~5、10~6、10~7CFU/mL)分别感染12 h后,利用蛋白免疫印迹(Western-blotting,WB)测定Bax、Caspase-3和Bcl-2的蛋白表达情况。研究结果显示:(1)利用两步酶消化法得到了形态、生长方式符合上皮细胞的子宫内膜上皮细胞,免疫细胞化学鉴定显示,子宫内膜上皮细胞的标志蛋白(波蛋白和角蛋白18)染色阳性。(2)利用Tunel检测细胞的凋亡情况结果显示,大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染组中,细菌浓度为10~7 CFU/mL时细胞凋亡率均最高,与其他组相比凋亡率显著增加(P0.05)。(3)qRT-PCR结果显示:大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染使Bax和Caspase-3表达增加(分别在10~6和10~7CFU/mL时表达量最高),同时,Bcl-2表达降低(在10~7CFU/mL时表达量最低)。(4)WB结果显示:大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染使Bax和Caspase-3蛋白表达量增加(分别在10~6和10~7CFU/mL时表达量最高);不同浓度大肠杆菌感染时Bcl-2蛋白呈低表达(在10~3CFU/mL时表达量最低),不同浓度金黄色葡萄球菌感染时,Bcl-2蛋白在细菌感染的初始阶段呈低表达,在细菌浓度10~6CFU/mL表达量最高(P0.05),随着细菌浓度继续升高,Bcl-2蛋白表达量降低。体外培养的BEECs在不同浓度的E.coli和S.aureus感染后,随着菌液浓度的升高,BEECs的细胞凋亡率随之升高,Bax和Caspase-3的mRNA表达量均呈上升的趋势,Bcl-2的mRNA表达量呈下降的趋势,并且Bax与Bcl-2的表达情况反映出了两种凋亡因子的互相拮抗作用;Bax和Caspase-3蛋白表达情况与其mRNA的表达情况也呈现出了相同的趋势,Bcl-2蛋白表达量整体呈低表达状态,其变化与Bax、Caspase-3的蛋白表达量表现出一定的相关性。本研究结果表明,E.coli和S.aureus可诱发子宫内膜上皮细胞凋亡,可为奶牛子宫内膜炎相关机制研究提供参考依据。
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