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《甘肃农业大学》 2020年
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抗牛病毒性腹泻病毒Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定

陈文龙  
【摘要】:牛病毒性腹泻/黏膜病是影响全世界养牛业的重要疾病,BVDV病毒亚型众多、宿主范围广。动物感染病毒后可引起机体免疫抑制,导致继发感染。BVDV是黄病毒科瘟病毒属RNA病毒;BVDV分为1种血清型,2种生物型和3种基因型。该病毒主要引起牛腹泻病、呼吸道疾病、生产性能下降等临床症状。BVDV还严重影响与牛相关的生物制品,如冻精、血清、抗体、疫苗等,对畜牧业国家造成严重的经济损失。我国自1980年在吉林省长春地区检测到BVDV病毒以来,全国感染动物阳性率逐年增加,最新数据显示我国BVDV阳性率已达到46.7%,持续性感染率达2.2%,严重阻碍畜牧业发展。因此探索BVDV阳性动物检测方法,消除BVDV传染源,对减少生产损失是有实际意义的。基于此本研究主要开展并完成了以下试验:1.BVDV Erns和E2全长基因克隆及序列生物信息学分析MDBK细胞增殖BVDV病毒,然后提取病毒RNA;设计Erns和E2基因全长引物,RT-PCR扩增目的基因;基因克隆载体后菌落PCR验证,最后测序,进行生物信息学分析。结果表明:试验成功扩增681 bp Erns全长基因片段;生物信息学预测Erns基因序列编码227个氨基酸,有信号肽,无跨膜区,并预测Erns蛋白为亲水性、分泌蛋白。成功扩增1122 bp E2全长基因片段;生物信息学预测E2基因序列编码374个氨基酸;有信号肽,无跨膜区且E2蛋白为亲水性、分泌蛋白。2.Erns、E2蛋白免疫小鼠多克隆抗体效价分析参考生物信息学分析结果,设计Erns和E2基因优化引物;PCR扩增基因,连接载体,菌液PCR及双酶切鉴定后生物公司测序,重组质粒转化大肠杆菌,IPTG法诱导其表达目的蛋白;SDS-PAGE验证蛋白表达形式及大小;弗氏佐剂联合重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体;间接ELISA测定多克隆抗体效价,Western blot、IFA验证多克隆抗体反应原性,最后比较Erns和E2蛋白制备的多克隆抗体效价水平。结果证明:大肠杆菌表达的Erns和E2重组蛋白均为不可溶性;Erns蛋白大小17 kDa,E2蛋白大小32 kDa;Western blot,IFA结果证实多克隆抗体与重组蛋白、细胞中病毒均有良好的反应性,证明纯化的重组蛋白免疫原性良好;制备的Erns和E2多克隆抗体效价均高于1:400000,且Erns多克隆抗体效价水平高于E2。3.抗BVDV Erns蛋白单克隆抗体制备及鉴定选取Erns蛋白作抗原,联合弗氏佐剂免疫小鼠,5次免疫后取小鼠肿大脾脏,制备免疫淋巴细胞,使用聚乙二醇融合脾细胞和骨髓瘤细胞制备杂交瘤细胞。利用筛选培养液培养细胞;显微镜观察细胞形态;ELISA测定抗体效价,Western blot和IFA验证抗体活性;经3次亚克隆筛选,鉴定能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞孔,重复测定效价后将阳性孔细胞扩大培养;细胞计数后无菌注射昆明鼠腹腔,制备腹水抗体;20 d后收集并鉴定抗体生物学活性。结果表明:试验制备出3株稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,且试验证明腹水抗体反应性良好,ELISA结果鉴定抗体效价高于1:50000。
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