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《甘肃农业大学》 2020年
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葛根素激活P38、ERK1/2信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖的研究

史冬雪  
【摘要】:目的:骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。多见于老年动物和绝育后动物。随着社会的发展,越来越多的宠物主人会选择为自己的爱宠做绝育手术,动物绝育后,体内雌激素水平会显著下降,雌激素水平降低可能会导致骨质疏松症的发生,但长期补充雌激素会增加动物患乳腺癌和对称性脱毛等疾病的风险,因此,研究者力图寻找一种安全性高、副作用小的雌激素替代物。葛根素是一种植物雌激素,对骨质疏松症的治疗效果与雌激素像似,但无雌激素的副作用。本研究拟在细胞水平和分子水平上研究葛根素对MC3T3-E1成骨细胞增殖所产生的作用,并观察其量效关系和时效关系。进一步通过抑制MC3T3-E1成骨细胞中MAPK信号通路主要成员P38和ERK1/2的活性后,观察比较下游蛋白及MC3T3-E1细胞増殖过程中标志物的表达情况,明确葛根素对MC3T3-E1细胞的作用机制并阐明其间所涉及的信号通路。方法与结果:在MC3T3-E1细胞培养基中加入不同浓度(0mol/L、10~(-7)mol/L、10~(-6)mol/L、10~(-5)mol/L、10~(-4)mol/L、10~(-3)mol/L)的葛根素,培养24h后收集细胞,用CCK-8法检测细胞增殖能力,用pNPP法检测各组细胞ALP的活力,结果表明,浓度为10~(-6)mol/L的葛根素对MC3T3-E1细胞增殖和ALP活力的促进作用最为明显。因此,使用浓度为10~(-6)mol/L的葛根素做后续实验。用浓度为10~(-6)mol/L的葛根素作用于MC3T3-E1细胞,分别培养24h、36h、48h和60h。用CCK-8法检测细胞增值情况,结果显示,培养48h时,细胞状态最好。因此,后续实验的细胞培养时间为48h。将实验分为空白对照组、葛根素组、葛根素+P38抑制剂组(PUE+SB203580)和葛根素+ERK1/2抑制剂组(PUE+SCH772984),使其作用于MC3T3-E1细胞,培养48h后,分别用CCK-8、pNPP和ELISA法检测各组细胞增殖能力、ALP活力和I型胶原分泌水平,Western Blotting检测各组P-P38和P-ERK1/2蛋白表达水平。结果显示,与空白对照组相比,葛根素组P-P38和P-ERK1/2蛋白表达水平明显增高,葛根素可以促进MC3T3-E1细胞增殖、ALP和I型胶原分泌。与葛根素组相比,葛根素+P38抑制剂组能够明显抑制P-P38蛋白的表达,葛根素+ERK1/2抑制剂组能够明显抑制P-ERK1/2蛋白的表达。加入P38和ERK1/2信号通路抑制剂组都能够明显抑制MC3T3-E1细胞增殖、ALP和I型胶原分泌。结论:葛根素可以通过激活P38、ERK1/2信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖,葛根素可以通过激活P38、ERK1/2信号通路促进MC3T3-E1细胞分泌ALP和I型胶原,从而促进MC3T3-E1细胞分化。
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