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《甘肃农业大学》 2020年
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山奈酚对金黄色葡萄球菌分选酶A的抑制作用研究

蒋成辉  
【摘要】:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)严重威胁人类和动物的健康。黏附是细菌引起感染的第一步。介导SA黏附的表面蛋白,包括纤连蛋白结合蛋白A、B(FnbpA和FnbpB),纤维蛋白原结合蛋白A,B(ClfA,ClfB),主要由分选酶A(SrtA)介导锚定于细胞壁上,在细菌黏附和逃避机体免疫过程中发挥了重要作用。因此,抑制SrtA活性,可以有效降低SA的毒力。山奈酚(Kaempferol)是源于植物根茎的一类黄酮类化合物,具有抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化等多种生物活性。研究发现,山奈酚对SA感染具有良好的抑制作用,但作用靶标尚不清楚。为验证SrtA是否为山奈酚的作用靶标,本研究以SA USA300为试验菌株,进行了以下研究:1.用CRISPR/Cas9技术构建USA300菌株srtA基因缺失株及其回补株。设计3对srtA基因sgRNA,以pCasSA为载体,构建pCasSA-sgRNA质粒。经缺陷型SA RN4220修饰后,转化USA300,检测pCasSA-sgRNA质粒的切割效率。扩增并融合srtA基因左右同源臂并将其插入pCasSA-sgRNA质粒中,构建敲除质粒pCasSA-sgRNA-srtA。敲除质粒经修饰后,转化USA300,经氯霉素筛选,PCR扩增及测序鉴定,获得srtA基因缺失株ΔsrtA USA300。以pLI50质粒为载体,构建回补质粒pLI50-srtA及回补株,获得回补株Δ::srtA USA300。2.山奈酚对SA生长的影响。通过微量稀释法测定山奈酚对USA300菌株最小抑菌浓度(MIC)。结果,山奈酚的MIC1024μg/mL。表明山奈酚对USA300菌株无抗菌活性。测定野生型WT USA300、ΔsrtA USA300、Δ::srtA USA300和不同浓度下山奈酚作用USA300菌株的生长曲线。结果,各菌株生长曲线一致。表明山奈酚不影响USA300菌株的正常生长。3.SrtA在SA致病过程中的作用及山奈酚对SA感染小鼠的保护作用。将SPF昆明小鼠随机分5组,WT USA300组、Δ::srtA USA300组、ΔsrtA USA300组和WT-山奈酚组,分别尾静脉接种2×10~8 CFU的菌液。WT-山奈酚组在感染WT USA300,2 h后,皮下注射剂量为150 mg/kg的山奈酚,2次/d。对照组注射0.1 mL生理盐水。记录各组小鼠死亡率,检测并比较各脏器组织荷菌量,取肾组织制作切片进行病理学观察,测定肾脏功能指标(肌酐、尿素氮)和炎症因子(TNF-α、IL-1β)水平。结果小鼠死亡率(10 d)分别为71.627%,67.5%(P0.05),30%,25.93%(P0.05)。脏器组织荷菌量:WT USA300组与Δ::srtA USA300组荷菌量水平相当(P0.05),ΔsrtA USA300与WT-山奈酚组相近(P0.05);ΔsrtA USA300组显著低于WT USA300组(P0.01,P0.05)。病理学观察:WT USA300组和Δ::srtA USA300组小鼠肾小球萎缩,坏死,肾间质充血、水肿,并可见较大面积的弥漫性出血。ΔsrtA USA300与WT-山奈酚组,肾组织病变相似,肾小球体积增大,毛细血管内皮细胞增生、肿大,可见局灶性轻微出血,但整体病变明显减轻。肾脏功能指标(肌酐、尿素氮)和炎症因子(TNF-α、IL-1β)水平:WT USA300组与Δ::srtA USA300组结果一致(P0.05)。ΔsrtA USA300组与WT-山奈酚组结果相当(P0.05)。ΔsrtA USA300组小鼠肾脏肌酐、尿素氮含量和炎症因子TNF-α、IL-1β水平极显著低于WT USA300组(P0.01)。表明WT-山奈酚组和ΔsrtA USA300组的结果高度一致,山奈酚和ΔsrtA USA300均降低了小鼠死亡率,缓解肾脏组织病变。4.山奈酚对SA SrtA及其所锚定的黏附蛋白fnbA、fnbB、clfA和clfB基因转录水平的影响。qRT-PCR检测结果显示,山奈酚下调了srtA基因转录水平,随着山奈酚浓度的增加,srtA基因的抑制作用呈梯度递增,当山奈酚浓度为64μg/mL,srtA基因被抑制了49%,且抑制作用不再随山奈酚浓度的增加而增加。而黏附蛋白fnbA、fnbB、clfA和clfB基因转录水平无显著性差异。表明,山奈酚是通过抑制SrtA转录水平,因此降低了细胞壁黏附蛋白的锚定,最终降低了SA的黏附效率。
【学位授予单位】:

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