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《甘肃农业大学》 2020年
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马铃薯StDRO1基因的功能验证

梁文君  
【摘要】:深根是植物生长过程当中的一个重要特征,因为它能更好地获取深层土壤中存在水分的养分,从而导致更高的产量。DRO1(DEEPER ROOTING 1)是IGT基因家族的成员,该家族在调控侧向器官生长方向中起着重要作用,而DRO1则通过调控根系生长角度形成深根性状来响应干旱胁迫。目前,DRO1在水稻、拟南芥和小麦中已有系统研究,但是马铃薯StDRO1基因的克隆、表达分析以及功能研究都还未见报道,需要进行初步的研究。本研究从马铃薯中成功克隆了StDRO1基因并对其进行生物信息学预测,初步分析了StDRO1对不同逆境的响应情况。为了进一步验证StDRO1的功能,构建过表达载体pBIB-BASTA-35s-StDRO1-GFP转化拟南芥,对转基因植株进行qRT-PCR,检测StDRO1基因的表达水平并筛选表达水平较高的株系。以StDRO1转基因拟南芥的T3代纯合转基因株系和dro1缺失纯合突变体拟南芥为试验材料,以野生型拟南芥(Col)作为对照,在干旱胁迫和生长素处理下观察拟南芥的根系表型并检测生理指标和基因相对表达量,探究StDRO1对干旱胁迫和生长素的响应。主要结果如下:1、本研究从马铃薯中克隆得到StDRO1基因,通过序列比对分析发现StDRO1基因包含5个外显子和4个内含子,开放阅读框全长是852 bp,编码283个氨基酸,相对分子质量为32 kDa,等电点为6.29。StDRO1蛋白与茄子和番茄的DRO1蛋白高度相似,其中与已经报道过的拟南芥的DRO1蛋白序列相似性为52.48%。生物信息学分析发现StDRO1蛋白不含跨膜结构域和信号肽,预测其可能定位于细胞质或细胞核中。2、在马铃薯试管苗中初步分析了StDRO1对不同逆境的响应情况,在干旱、高盐、低氮、低磷,以及生长素和油菜素内酯6个不同处理下,测定了三个马铃薯品种大西洋、C119、C16试管苗的表型和生理指标以及StDRO1基因的相对表达量,发现StDRO1基因强烈地响应干旱胁迫,其相对表达量受生长素的正向调控,并参与调控马铃薯株高、根长、叶绿素含量和SOD活性。3、构建了pBIB-BASTA-35s-StDRO1-GFP过表达载体,在烟草中的亚细胞定位证明其定位于细胞膜上,用农杆菌浸花法将过表达载体分别转入dro1缺失纯合突变体拟南芥(SA)和野生型拟南芥(Col)中,进行PCR鉴定并成功获得SA-DRO1和Col-DRO1过表达株系,各选择表达量较高的1个转基因株系SA-DRO1-10和Col-DRO1-1进行表型观察和统计,并进行后期的干旱胁迫和生长素处理。4、通过对转基因株系的表型观察和统计,发现StDRO1基因特异性地调控拟南芥的侧根角度、侧根数和根尖角度,而对于主根长无明显的调控作用。侧根角度的显著变化说明StDRO1基因特异性地调控侧根角度,这与拟南芥AtDRO1基因的生理特性相同。转基因拟南芥的根尖角度也发生了显著地变化,说明StDRO1可能参与调控重力信号的响应,而向地性是决定根系生长角度的重要因素之一。5、用75 mmol·L~(-1)甘露醇处理转基因株系,发现Col-DRO1-1的侧根角度相比野生型减小,而SA和SA-DRO1-10的侧根角度相比野生型增大。两个转基因株系Col-DRO1-1和SA-DRO1-10的侧根数和根尖角度与野生型相比显著增加(P0.05),而主根长与野生型相比无显著性变化。过表达株系与CK相比,其SOD、POD、CAT、MDA、脯氨酸和叶绿素的含量都显著升高(P0.05)。两个过表达株系的StDRO1基因相对表达量与CK相比显著升高(P0.05),说明StDRO1基因能强烈响应干旱胁迫,其所调控的根系表型在干旱胁迫条件下有利于提高植株的抗旱性。6、用0.1μmol·L~(-1) 2,4-D处理转基因株系,发现高浓度的生长素严重抑制了拟南芥的生长发育,SA-DRO1-10和Col-DRO1-1两个转基因植株的POD、SOD、CAT、MDA、脯氨酸和叶绿素含量都显著升高CK(P0.05)。两个过表达株系Col-DRO1-1和SA-DRO1-10的StDRO1基因相对表达量与CK相比显著升高,说明StDRO1基因强烈响应生长素,可能参与调控生长素的信号转导。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2020
【分类号】:Q943.2;S532

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