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《甘肃农业大学》 2000年
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马铃薯小孢子原生质体游离与培养的研究

王玉萍  
【摘要】: 小孢子原生质体兼具单倍体和原生质体的双重忧点,是植物细胞工程 中一种特殊的实验体系,并可作为马铃薯“分解-综合育种”方案中的一个 重要组成部分。本实验以3个优良四倍体栽培种甘农薯1号、甘农薯2 号、甘农薯3号以及1个双单倍体81-15的不同发育时期的小孢子(四分 体、单核花粉、成熟花粉粒)为供体材料,初步研究了小孢子原生质体游 离与培养的基本条件及影响因素。结果表明:(1)用1%蜗牛酶+1.2%纤 维素酶+0.8%半纤维素酶的酶类组合能高频率地游离出“甘农薯1号”, “甘农薯2号”,“甘农薯3号”以及“81-15”的四分体原生质体,最高 游离率分别达75.17%,71.43%,78.05%以及54.19%;(2)单核期的幼嫩 花粉不能游离出原生质体;(3)用“低温-萌发-酶解”三步法游离出“甘 农薯1号”,“甘农著2号”以及“甘农著3号”的成熟花粉原生质体, 最高游离率为10.12%,9.70%和17.71%;(4)在四分体原生质体游离过 程中用蔗糖作渗透压调节剂,最适浓度10.3%,而从成熟花粉中游离原生 质体则用甘露醇做渗透压调节剂效果较好,最适浓度为18.2%;(5) 30min的萌发时间最适于游离成熟花粉原生质体;(6)适当降低酶浓度, 有利于减少原生质体的破碎及后期培养过程中多核现象发生,有利于提高 原生质体的活力;(7)酶液中添加各种保护剂(MES,PDS,PVP)对减 少原生质体的破碎和褐化现象,提高其活力具有一定效果。 对小孢子原生质体培养的研究结果表明:(1)在原生质体培养液中加 2,4-D1.0mg/L,KT 0.5mg/L,6-BA 0.4mg/L;去除NH_4~+,NAA能提高四 分体原生质体的稳定性,降低后期培养过程中的出芽率,提高分裂频率; (2)高Ca~(2+)和高H_2PO_4~-浓度的K_3培养基和“药壁因子”的加入显著提高 了低密度(IX10’个/ml)四分什原生质体的分裂频率;(3)花蕾低温预 处理对于四分体原生质体的脱分化以及诱导其分裂起了重要作用,在液体 浅层培养中,使植板密度为 IX!0‘个/mL培养细胞的分裂频率达到 ’ 12石%:(4)在蔗糖密度梯度离心中,位于20%蔗糖液面的四分体原生质 体较位于25%蔗糖液面的启动分裂所需的时问短,原生质体持续分裂能力 强;(5)成熟花粉原生质体在培养中不能诱导分裂;(6)在原生质体的 培养过程中,对四分体原生质体用固液双层培养法和液体浅层培养法效果 好,细胞持续分裂能力强:()花药愈伤组织与四分体原生质体基因型差 异较小的的看护作用明显,反之效果较差。
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