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《甘肃农业大学》 2002年
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绵羊精液超低温冷冻程序及稀释液优化方法的研究

陈亚明  
【摘要】: 本研究通过系列试验,对绵羊精液冷冻优化程序、稀释液优化配方、影响冷冻-解冻精子受胎率的因子、冷冻降低冻精受精能力的机理和绵羊精液品质模糊综合评定方法的建立等5个方面进行了深入探索,研究结果表明: 1.以冷冻—解冻精子活力、生存指数、顶体完整率和精浆中GOT释放量等为评价指标建立如下绵羊精液冷冻优化程序:(1)精液与稀释液按1:3稀释→(2)二次稀释法:38℃下用Ⅰ液(不含甘油)稀释精液,4℃下再加入Ⅱ液(含甘油)→(3)200ml体积水浴2.5h水浴平衡法→(4)-110℃~-120℃下滴冻→(5)38℃水浴中每2粒冻精加50μlVB12解冻。 系列试验发现,38℃下200ml体积水浴2.5h平衡到4℃(降温速率为0.23℃/min)的平衡方法比8层纱布包被、50ml、100ml、150m体积水浴平衡方法对绵羊冷冻-解冻精子有较好的保护效果(P<0.05)。38℃下VB12解冻优于55℃或65℃以上高温解冻(P<0.05),是生产条件中简便而有效的解冻方法。绵羊精液颗粒冷冻稀释液适宜的最终甘油浓度为4.5%,二次稀释法比一次稀释法能够显著减少精子GOT、LDH和ALP释放量(P<0.05)。 2.通过逐步优化筛选出9个冷冻稀释液优化配方:(1)稀释液Ⅰ:3.0285g三基—1.6593g柠檬酸—2.5673g蔗糖—卵黄15%(v/v)—甘油4.0%(v/v)—青霉素和链霉素分别为10万单位;(2)稀释液Ⅱ:稀释液Ⅰ+0.75g果糖;(3)稀释液Ⅲ:稀释液Ⅱ+6mlVB6;(4)稀释液Ⅳ:稀释液Ⅱ+6mlVE;(5)稀释液Ⅴ:稀释液Ⅱ+6mlVm2;(6)稀释液Ⅵ:稀释液Ⅱ+0.3g谷氨酸;(7)稀释液Ⅶ:稀释液Ⅱ+20mg山梨醇;(8)稀释液Ⅷ:稀释液Ⅱ+fmlF;(9)稀释液Ⅸ:稀释液Ⅱ+6mlVB6+6mlVE+fmlF。 冷冻—解冻精子活力、生存指数、顶体完整率由优化开始的0.41、3.69、41.73%分别增加到0.52、6.83、54.59%(分别提高26.84%、86.10%、29.86%);GOT、LDH、ALP释放量由优化开始的369.01、1577.68、626.89分别减少到210.37、932.16、403.47(分别降低42.99%、40.92%、35.64%)。 发现蔗糖稀释液比乳糖、葡萄糖和果糖稀释液对冷冻-解冻精子顶体完整率能提供更强的保护效果(P<0.05),能有效降低GOT的释放量(P<0.05)。三基-蔗糖-卵黄稀释液中添加0.75g果糖有显著提高顶体完整率的效应(P<0.05)。维生素B6、VE、B12能够显著提高冷冻-解冻精子的活率。VE和B6对解冻精子顶体保护效果较好,并能提高生存指数。VE、B6和B12有降低精浆中GOT、LDH和ALP活性释放量的作用。谷氨酸和山梨醇在保护精子冷冻方面有一定效果。F对冷冻-解冻精子的存活时 间有明显的延长效果,最长可达35h。添加鱼腥草后精子运动速度明显加 快,头部侧摆幅度加大,尾部鞭打样运动频率增加,似有超激活现象。 3.在自然发情子宫颈输精条件下,稀释液1、稀释液皿、稀释液IV。 稀释液伽和稀释液k的30d不返情率(O)分另为30.95O、50.00O、38.75O、 48刀8%和60。61%。不返情率与解冻活率、输入有效精子数、顶体完整率、 输精深度、宫颈颧液存在一定的正相关,与精浆中GOT、LDH和ALP释 放量有一定的负相关关系。 4.通过鲜精和冷冻一解冻精子质膜顶体超微结构变化的对比观察初 .步阐明冷冻降低绵羊精子受精力的机理。根据绵羊精子头部形态的超微结 构特征划分为5类:质膜顶体无可见变化、质膜膨大顶体无可见变化、质 膜丢失顶体膨大、外膜皱招核质不均和外膜破裂核质外溢的精子,前两类 是尚具有受精能力的精于,后三类是丧失受精能力的精子。稀释液议、稀 释液*、稀释液 N、稀释液\M冷冻一解冻精子授精 3 cd不返情率高于稀释 液1的原因是在提高前两类精子比例的同时降低了后三类精子的比例。稀 释液具有受精能力的前两类精子的排序为:稀释液出>稀释液*I>稀释液 W>稀释液皿>稀释液工分别为5二斗7%、啊刀5%、壮*6%、叩.叩%、 35.88%)。。稀释液具有丧失受精能力的后三类精子的排序为:稀释液秩< 稀释液H卜稀释液w<稀释液皿<稀释液I(分别为17.刀%、叨*6%、 52.59O、54.74O。55.ZI%、64.12%)。由此阐明稀释液K不返情率高于其 它稀释液的原因是稀释液IX对绵羊精子具有较强的低温保护效果,经冷冻 -解冻过程其质膜顶体完整的精子数高于其它稀释液。同时发现稀释液IX、 稀释液*、稀释液I\’、稀释液皿对冷冻一解冻精子线粒体有较好的低温保 护效果。 5.建立了对实际生产具有指导意义的绵羊精液品质模糊综合评定方 法。应用模糊数学方法,计算每头种公绵羊的综合得分并排序:①151种 公羊,总分0.8984>②1021种公羊,总分0.8908>③597种公羊,总分 0.8850In④235种公羊,总分 0.8804>⑤173种公羊,总分 0.8746to③99
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S826.3

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【引证文献】
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3 田亚丽;稀释液中添加海藻糖对波尔山羊冻精品质的影响[D];山西农业大学;2005年
4 祝发明;波尔山羊冷冻精液稀释液配方研究[D];西北农林科技大学;2003年
5 哈福;绵羊冷冻精液稀释液及解冻液的研究[D];甘肃农业大学;2000年
6 丁瑜;优质肉羊精液冷冻稀释液的研究[D];吉林农业大学;2005年
7 赵文娟;无醇啤酒新型生产方法的研究[D];山东轻工业学院;2007年
8 韩雪峰;鸭精液冷冻保存技术研究[D];西北农林科技大学;2004年
9 易康乐;水牛冷冻精液稀释液配方改进的研究[D];广西大学;2005年
10 潘瑞;渗透压、初冻温度及保存期对鸡精子冻后活率的影响[D];甘肃农业大学;2008年
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