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《甘肃农业大学》 2003年
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牦牛瘤胃微生物基因组文库构建与16S rDNA生物多样性研究

安登第  
【摘要】: 可再生资源利用是人类可持续生存和经济可持续发展的基础,自然界最丰富的可再生资源是纤维素类物质,总量占全部可再生资源的80%。尽管纤维素类有多种用途,但为人类提供食品是其最主要的功能,而将这类物质转化为食品的唯一且高效途径是反刍动物,但反刍动物本身并不能消化纤维素类物质,必须依赖栖居在瘤胃中的大量微生物。 但由于瘤胃微生物系统的复杂性,至今人们对其认识尚甚少。对瘤胃微生物的研究经历了三个阶段,现正在进入第四阶段——生物技术阶段,以16S rDNA序列为指标的物种进化和多样性分析使认识和了解瘤胃微生物更加简捷和有效;酶基因重组和再转入对调节和改善瘤胃代谢也有显著作用。 牦牛是生活于高寒地带的、受人类活动影响最少的、具有典型地方特色的动物,以天然牧草为唯一饲料来源,生活环境保持在自然、原始状态,其瘤胃微生物有其显著的环境和地理特征:结构完整、保存完善且未受污染。由于这些原因,特别是饲料类型比较单一且恒定,瘤胃微生物群落和组成保持在原始稳定状态,是研究瘤胃微生物最好的出发材料,其资源特性更加明显,特别是纤维素、木质素分解类微生物是可再生资源利用和环境保护的重要微生物资源。 为尽可能了解牦牛的瘤胃微生物组成和特点、保护其微生物基因资源和为进一步研究构建技术平台,本项目进行了如下几方面的研究: 1、牦牛瘤胃内容物微生物总DNA提取及性质分析 目的:由牦牛瘤胃内容物高效获得尽可能全面代表瘤胃微生物种类的、全面保存遗传资源的、片段尽可能大的、不被其它来源DNA污染的可用于分子生物学研究的微生物遗传物质。 结果:实验了液氮、干冰—酒精冻融法和离心沉淀—碱裂解法提取微生物总DNA的方法,结果证明干冰-酒精冻融法获得的DNA片段较大,每克瘤胃内容物获粗制DNA40μg,经纯化得20kb以上的DNA 15μg。经Pst Ⅰ和Eco RV 耗斗疗胄微生物基因组文瘁构丈与165 ro*A生抽多佯性研允 *bs汀SCt 酶切检验证明符合分子生物学操作要求,且未被其它来源的DNA污染。 2、牦牛瘤胃内容物微生物基因组文库构建 目的:建立覆盖面广、具有重要基因资源保护和进一步筛选有价值基因的 基因组文库。 结果:以提取并纯化的牦牛瘤胃内容物微生物总DNA为出发材料、以 pKC505粘粒为载体构建了 cosmid基因组文库。经检验文库滴度为 6.7 XI 0’/pg 基因组 DNA,插入片段长度 17上5kb,平均 21.skb,包含 1.4405 X 10’个碱基 的重组基因组序列,是一个覆盖面广、功能完善的基因组文库。这一文库的构 建为研究和利用具有典型地方特色的牦牛瘤胃微生物资源提供了技术平台。 .3、牦牛瘤胃微生物 16s rDNA生物多样性研究及与晋南黄牛的比较 i l 目的:以役肉兼用型晋南黄牛为比较对象研究牦牛瘤胃的微生物生物多样 性,了解其组成和特点,为进一步研究瘤胃微生物生态提供依据。 结果:以甘肃天祝牦牛和晋南黄牛瘤胃内容物微生物总DNA为模板,以 .通用引物530f和 1492r经聚合酶链式反应(PCR)扩增构建 16s rDNA文库, l .随机挑取阳性克隆子进行部分序列测定,分别获得 184个和 ZIS个有效序列, + .经与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因序列数据库比对及DNAMAN软件分 析,结果表明:①样品总DNA提取方法合理,经PCR扩增获得了覆盖广范的 【16s rDNA序列,且没有被其它来源的 DNA污染;②采用 30次PCR循环获得 Z 了良好的 16s序列覆盖;③牦牛瘤胃微生物组成以分解纤维类物质为主,未发 5 现分解淀粉的微生物,而黄牛瘤胃微生物中纤维素分解菌比例较低,但淀粉分 R 3 解菌的序列显著较多。同时分析表明,牦牛瘤胃微生物 184个序列中最接近未 :培养种类达 144 个,而黄牛为 218 个中 127 个,分别占 78.26O和 58.25O,黄 二 牛的瘤胃微生物组成与已报道的奶牛、肉牛接近,所以牦牛瘤胃微生物组成和 .种类可代表最原始和最稳定的瘤胃微生物结构,其资源价值更高,具备用于可 l 再生资源开发的潜力。研究结果的16s n3:NA序列共370个提交并注册到国际 2 基因数据库,其中牦牛183个,黄牛187个,注册号分别为AY311600-AY3ll782 ( $0 AY315198-AY315384。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S823

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【引证文献】
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4 记者 巴桑次仁;类乌齐县组建牧民牦牛育肥协会[N];西藏日报;2008年
5 宋海云;我州首个牦牛扩繁基地在久治建成[N];果洛报;2010年
6 索穷;“高原迎宾第一人”[N];西藏日报;2003年
7 娜娜;雅江牦牛改良走出困境[N];中国畜牧兽医报;2008年
8 普穷;牦牛冬春季放牧注意事项[N];西藏日报;2002年
9 本报记者 王开波 李成业;“羚羊速度”与“牦牛精神”[N];西藏日报;2010年
10 记者 朱颖;我区成立牦牛研究与发展中心[N];西藏日报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 安登第;牦牛瘤胃微生物基因组文库构建与16S rDNA生物多样性研究[D];甘肃农业大学;2003年
2 王召锋;牦牛驯化和适应:线粒体基因组证据[D];兰州大学;2011年
3 孙小琴;放牧奶牛乳脂肪酸组成及瘤胃脂肪酸代谢规律的研究[D];西北农林科技大学;2012年
4 鱼小军;牦牛粪维系青藏高原高寒草地健康的作用机制[D];甘肃农业大学;2010年
5 张春梅;植物油及十八碳不饱和脂肪酸对瘤胃甲烷生成和微生态的影响[D];浙江大学;2008年
6 王晓旭;围产期奶牛瘤胃微生物区系的变化及微生态制剂的调控作用[D];吉林大学;2012年
7 杨世华;几种生殖激素对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡的影响[D];甘肃农业大学;2002年
8 霍鲜鲜;瘤胃厌氧真菌在纤维降解中的作用及其与细菌、原虫的关系[D];内蒙古农业大学;2003年
9 李彦欣;异种克隆牦牛,羚牛及相关机理的研究[D];中国农业大学;2004年
10 张勇;双峰驼和牦牛繁殖季节褪黑素与促性腺激素之间的关系[D];甘肃农业大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王国生;牦牛能量物质转运及代谢的部分相关基因的克隆测序、表达谱及多态性研究[D];西南民族大学;2011年
2 张莹;牦牛适应高寒营养胁迫的尿素氮代谢机制[D];兰州大学;2010年
3 郝明超;牦牛乳腺上皮细胞系的建立与生物学特性研究[D];甘肃农业大学;2012年
4 刘文杰;添喂赖氨酸对小尾寒羊瘤胃和整体消化代谢的影响[D];新疆农业大学;2012年
5 姚志诚;贺兰山野化牦牛食性研究[D];东北林业大学;2012年
6 孙凯;牦牛病毒性腹泻/粘膜病病毒全基因的测序、表达与生物信息学分析[D];西南民族大学;2012年
7 王建华;瘤胃保护性氨基酸的研制及其对内蒙古白绒山羊消化代谢影响的研究[D];内蒙古农业大学;2004年
8 王丽铭;GY公司牦牛养殖项目的可行性研究[D];西南财经大学;2005年
9 候彩云;棉酚对绵羊瘤胃微生物种群及纤维物质降解的影响[D];内蒙古农业大学;2012年
10 严学兵;牦牛对高寒牧区天然草地和人工草地牧草消化性的研究[D];甘肃农业大学;2000年
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