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《甘肃农业大学》 2003年
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马铃薯PPO活性变化规律及抗块茎损伤褐化的基因工程研究

王清  
【摘要】:多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,简称PPO)酶促褐化是导致马铃薯(Solanum Tuberosum.L)块茎损伤褐化及加工产品口感和色泽不良的重要原因。通过对加工型马铃薯品种不同组织及部位在不同生长期内PPO活性变化规律的研究,使我们有可能针对目的PPO基因进行克隆,构建相应的反义基因植物表达载体,并最终获得抗块茎损伤褐化兼具各种优良特性的马铃薯加工型品种。本研究成果如下: 1.采用比色法对“甘农薯1号”、“甘农薯2号”、Shapedy、Snowden和Norvalley 5个加工型马铃薯品种在生长阶段的PPO活性进行了研究。结果表明:叶片、匍匐茎、块茎及花药等组织中PPO活性发生着规律性的变化。其中,叶片PPO活性表现出低—高—低的波动,并于现蕾至块茎膨大期达到高峰[31.12 (0.01 ΔOD.min-1)];块茎PPO活性呈现高—低—高—低的趋势,在块茎初形成时活性最高,达到60.60(0.01 ΔOD.min-1);花药PPO活性的变化规律与叶片相同,呈现低-高-低的趋势,并在盛花期达到高峰[129.80 (0.01 ΔOD.min-1)]。另外,在同一生长阶段(6月25日-7月24日),不同组织器官的PPO活性具有一定的差异,其中花药PPO活性 匍匐茎花蕾、花瓣 叶片、块茎,以花药组织PPO活性最高,达68.30 (0.01 ΔOD.min-1)。贮藏待播的块茎芽PPO活性明显高于块茎本身。进一步检测结果表明,即便是同一组织的不同部位PPO活性也呈现较大差异,如块茎外皮薄壁细胞组织PPO活性最高,髓薄壁细胞组织最低。 2.对马铃薯试管苗、茎段愈伤组织、块茎及块茎芽在不同温度、不同pH条件下PPO的活性进行了研究,发现pH对马铃薯PPO活性具有明显的影响;在pH 5.0~5.5,块茎芽以及愈伤组织PPO活性最高,分别为94.20及20.40(0.01ΔOD.min-1),而试管苗在培养基pH为8.0时PPO活性最高(19.80(0.01ΔOD.min-1))。不同温度下的不同品种PPO活性不同,“甘农薯1号”、Atlantic试管苗PPO活性在18℃~25℃之间达到高峰,分别为16.80和37.20(0.01ΔOD.min-1);Shapedy、Snowden试管苗在5℃下PPO活性最高;而检测的贮藏块茎PPO活性均在25℃表现最高。 3.研究6种褐化抑制剂Vc、AgNO3、L-半胱氨酸、硼酸、柠檬酸和偏重亚硫酸钠对马铃薯叶片、茎段和块茎PPO活性的抑制效果,发现6种褐化抑制剂对马铃薯茎粗酶液PPO活性的抑制效果明显强于叶片和块茎。但不同抑制剂对块茎和叶片的抑制状况不同,其中L-半胱氨酸,柠檬酸抑制块茎褐化效果优于对叶片的抑制;而Vc、AgNO3、硼酸和偏重亚硫酸钠则表现出对叶片褐化具有更强的抑制作用。通过试验找出了不同褐化抑制剂对不同组织PPO活性的最佳抑制浓度。 4.从马铃薯品种“甘农薯1号”试管苗叶片中提取总DNA,根据GenBank中的马铃薯多酚氧化酶基因(POT32)序列,设计合成了2对特异引物,通过PCR获得1840bp和476bp的扩增产物,将扩增产物与PMD-18T载体连接,并转化E.coli DH5α,得到2个重组子PMDPPOqc和PMDPPOty。对其进行基因测序,结果表明,1840bp的扩增产物与GenBank中发表的序列一致,同源性达到98%,476bp的扩增产物正是欲扩增的马铃薯多酚氧化酶基因的同源片段。将2个扩增产物反向连接到表 WP=3 达载体PC3中,通过双酶切鉴定后,定义2个反义基因表达载体为PC3-ASPPOqc、PC3-ASPPOty。采用直接导入法将反义基因植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105,经PCR鉴定证明,此质粒已整合到农杆菌Ti上,证明得到了农杆菌工程菌EHA105+PC3-ASPPOqc和EHA105+PC3-ASPPOty。 5.用农杆菌工程菌EHA105+PC3-ASPPOqc和EHA105+PC3-ASPPOty对Atlantic、“甘农薯1号”、“甘单花9号”和Norvalley进行遗传转化,得到叶盘预培养2d,侵染10min,共培养3d出愈率、抗性愈伤组织频率和转化率最好,最高可达86.3%,41.67%和3.1%。茎段预培养3d,侵染8min,共培养3d的出愈率、抗性愈伤组织频率和转化率最高,分别为80.2%和43%和3.05%。微型薯及试管微型薯愈伤组织形成缓慢,但两者侵染时间均以10min为好。其中试管微型薯出愈率、抗性愈伤组织频率和转化率分别为69.7%、52.8%和5.4%。而卡那霉素敏感性实验结果表明,叶盘选取25 mg/LKan、茎段,叶柄选取75 mg/LKan、微型薯和试管微型薯选择50mg/LKan作为选择压最为适宜。 6.农杆菌介导的PPO反义基因表达载体转化马铃薯以试管微型薯的转化频率最好,在不同侵染时间、不同共培养时间处理下,其平均转化频率可达5.4%;其次为茎段和叶片的转化效率,平均转化频率分别为3.05%和3.1%;微型薯转化效率最差。 7.在供试的4个品种中,目前已获得“甘单花9号”、Norvalley转化苗,” “甘单花9号”、Atlantic抗性愈伤组织。经PCR检测、Southern杂交确定,转化植株呈阳性。进一步检测结果表明,转化植株块茎和抗性愈伤组织PPO活性比对照明显降低。
【学位授予单位】:甘肃农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S532

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